تحضير عدة للكشف عن العامل الرثوي RF في الدم بطريقة اللاتكس

Abstract

الخلاصة تم في هذا البحث تحضير عدة للكشف عن وجود العامل الرثوي Rheumatoid Factor في مصل المرضى المصابين بالتهاب المفصل الرثواني Rheumatic Arthritis حيث تتكون العدة من حبيبات اللاتكس المطلية بالكلوبيولين المناعي صنف G بتركيز معين والامصال الموجبه (نموذج السيطره الموجب) والامصال السالبه (نموذج السيطره السالب) . استخدم الكلوبيولين المناعي صنف G بعد فصله وتنقيته باستخدام مادة DEAE-cellelose حيث تم ترسيب بروتينات المصل البشري باستخدام محلول كبريتات الامونيوم المشبعه ومن ثم تم التخلص من املاح الامونيوم باستخدام الديلزه ضد المحلول الملحي NaCl في 4°م وبعد ذلك يمرر المحلول على عالق DEAE-cellulose حيث يتم فصل الكلوبيولين المناعي صنف G.

Key word: Rheumatoid المقدمة يصاب بعض الاشخاص احياناً باحد امراض المناعه الذاتيه Autoimmune disease ومن هذه الامراض هو التهاب المفصل الرثواني Rheumatic Arthritis الذي يتميز بالآم شديده في مفصل او عدد من مفاصل الجسم وتورم هذه المفاصل واحمرارها مع ارتفاع درجة حرارة الجسم 0 لقد وجد عند اجراء الفحص النسيجي لمنطقة المفصل وجود تثخن في النسيج المصلي ونخر وترشيح خلوي للخلايا اللمفاويه البلازميه 0 تتضمن اعراض هذا المرض تكوين معقدات مناعيه في الانسجه المفصليه وهذه المعقدات عباره عن كلوبيولينات مناعيه صنف G مع الاجسام المضاده لها والتي سميت بالعامل الرثوي Rheumatoid factor. ان وجود هذه المعقدات في منطقة المفصل تنشط المتمم والذي يؤدي الى جذب الخلايا الدمويه البيضاء الى فراغ المفصل وهذه العمليات تؤدي الى حدوث تلف في الاغشيه الزليليه المفصليه وظهور اعراض المرض. يشخص هذا المرض اعتمادًا على الاعراض السريريه والصور الشعاعيه للمفاصل ويدعم باجراء الفحوصات السيرولوجيه . ان الاسباب المباشره لحدوث المرض لازالت غير معروفه ولكن هناك عدة احتمالات تساعد على ظهور الحاله المرضيه وهي : 1. العامل البيئي. 2. العامل الوراثي. 3. عامل المناعه الذاتيه المتمثل بفرط كاماكلوبيولين الدم Hypergamma globulinemia وظهوراجسام مضاده ذاتية Auto anti bodie خصوصًا العامل الرثوي Rheumatoid factor وكذلك ظهور معقدات مناعيه كذلك فضلاً عن الارتشاح الشديد بالخلايا اللمفيه والبلازميه للاغشيه .

أعراض المرض : يتصف المرض بانه التهاب مفصل متعدد مزمن يؤدي الى تدمير وتشويه المفاصل اذا لم يعالج مبكراً ، تبدأ هذه العلامات السريرية بعد حوالي ثلثي الفترة من تاريخ الاصابة بالمرض وبشكل مخاتل مع تعب شديد وفقدان الشهيه للطعام وضعف عام بما في ذلك الضعف الجنسي,وقد يؤدي الروماتويد الى الاجهاد ,فقر الدم,نقص الوزن والحمى. أما الاعراض الخاصه فانها تظهر عادة بشكل تدريجي بحيث تصيب مفاصل متعدده وخصوصأ مفاصل اليدين والمعصم والركبه والقدمين من ألم وتيبس وتورم فيحمر المفصل ويكون دافئأ ,ويختفي عادة الشعور بالتيبس بعد ساعه وتكون الاصابه متناظره في كلا الجهتين من الجسم ,وتصبح اسوأ عند استيقاظه في الصباح او بعد فتره طويله من الجلوس والنوم ويقل شعوره بالألم مع تقدم ساعات النهار .ويشتكي المريض من ضعف جسمي وشعور بعدم الراحه وفقدان الشهيه للطعام وبالتالي فقدان الوزن وتعب شديد خلال فترة بعد الظهر بين الثالثه والرابعه وقد يحدث عند بعض المرضى فقر دم أو التهاب العينين او ذات الجنب او عقيدات تحت الجلد والتي غالبا ما توجد على الوجه الخلفي للمرفق ونتيجه للضغط المتكرر قد تتقرح هذه العقيدات وقد تختفي بدون أن تسبب أي مشاكل. التشخيص: علماء الرماتيزم اكتشفوا ان دم 75% من الناس الذين يعانون من التهاب المفاصل الروماتيدي يحوي اجسامآ مضاده تدعى العوامل الرثوانيه الروماتيديه(RF),مع الاشاره الى ان هذا العامل قد يوجد في امراض اخرى غير الروماتويد . العلاج : إن أهداف العناية والعلاج الحديث هي: 1. تسكين الآلآم 2. الحفاظ على القدرة الوظيفيه وتحسينها 3. الوقايه من التشوه 4. تصحيح التشوه الموجود 5. وقف تقدم المرض ان امكن. اما العلاج الطبيعي فيلعب دورا هاما في علاج الروماتويد وله غايتان : 1- تسكين الآلام 2- تفادي تيبس المفصل اوحدوث التشوهات والعاهات المفصليه والمحافظة على قوة العضلات والحفاظ على الحركه الكامله للمفصل . اما الادويه المستعمله في علاج الروماتويد فهي: سلفاسلازين والادويه المضاده للملاريا ,ابر الذهب ,ميثوتركسات ,ازاثيابرين ,سيكلوسبورين والكورتيزون .

المواد وطريقة العمل : 1- استخلاص الكلوبيولين المناعي IgG من مصل الدم تم فصل المصل من البلازما بإضافة 0.25 مليغرام من كلوريد الكالسيوم لكل 100 مل من البلازما تم ترسيب الكلوبيولينات المناعية بإضافة كبريتات الامونيوم بنسبة إشباع 30 % وذلك لترسيب الكلوبيولين المناعي صنف G للمصل . وللتخلص من تاثيرات الملح تم اخذ نموذج من المصل المحضر في الخطوه السابقه وتمت ديلزتها ضد الماء المقطر،بعدها وضع كيس الديلزه وبداخله النموذج المستخلص في كمية من السكروز كافيه لتغطية كيس الديلزه للتخلص من الماء لكي يتركز النموذج لحين اكمال خطوات العمل . من أهم المبادلات هي (DEAE ) Diethyl amino ethyl-celluloswe وCarboxy methyl-Cellose لكن الأول يمتاز بكونه مثاليا" لفصل البروتينات ذات قيمة PI الطبيعية. (PI يمثل قيمة نقطة التعادل الكهربائي للكلوبيولين المناعي). مثل مكونات المصل والانزيمات والببتيدات ومتعددات السكريد ،انواع RNA ،الفايروسات، اللبيدات والاحماض الامينية. ويتم ازاحة البروتينات المرتبطة عن المبادلات بطريقتين : 1- زيادة القوة الأيونية للوسط مثل زيادة تركيز ايونات المحلول الدارىء مما يزيد من التنافس ما بين هذه الايونات والبروتينات المرتبطة على المجاميع المشحونة على سطح المبادل ألايوني. 2- تغيير قيم الرقم الهيدروجيني فأذا كانت مقاربة لقيمة نقطة التعادل الكهربائي للبروتين المعني فأن صافي الشحنة سيكون مساويا" للصفر وبذلك لايتمكن البروتين من الارتباط بالمبادل ألايوني.وتمتاز هذه الطريقة بسعتها العالية للنموذج ومحافظتها على الفعالية البايولوجية للبروتين المستخلص. ولا تمام عملية التنقية استخدمت تقنية كروموتوغرافيا الترشيح الهلامي باستعمال هلام Sephadex G-200 لتنقية الكلوبيولين المناعي المستخلص ثم طلاء حبيبات اللاتكس بالكلوبيولين المناعي صنف G. طريقة إجراء الاختبار: تخفف عينه مصل الدم المراد فحصها بنسبة 20:1 بدارئ الكلايسين الملحي تضاف قطره واحده (100 مايكروليتر) من كاشف اللاتكس المرتبط بالقرب من قطره واحده من مصل الدم المخفف المراد فحصه على شريحة التفاعل . يتم خلط اللاتكس مع العينه المراد فحصها خلال دقيقتين باستعمال عيدان خاصه . يلاحظ التلازن باستعمال الضوء او عند هز الشريحه باليد ويراقب تكوين التلازن وفق درجة العالق. تعامل السيطرات الموجبه بصوره متشابهه وعند قياس عينات المرضى. النتائج استخدمت العدة المحضرة لقياس وجود العامل الرثوي في مصل الدم لـ 20 نموذج لاشخاص طبيعيين ومرضى تم الحصول عليها من مختبر الصحة العامة المركزي . المناقشة مما تقدم فان العدة ذات مواصفات جيدة جدا مقارنة بعمل العدة الاجنبية ويمكن الاعتماد عليها لتمويل وزارة الصحة باحتياج القطر من هذه العدة لتوفير عملة صعبة اضافة الى استثمار الطاقات العلمية المتوفرة في المركز وتشغيل الايدي العاملة ويؤسس لصناعة حديثة في البلد.

المصادر 1-Hanson S.L.,Mazer,F.D and Klinefilter H.P A Clinical Evaluation of Acard Agglutination test for Rheumatoid Factor .Amer. J. Clinical pathology 73:110-113. 2-Brad well AR.Catty Dand Houba V.Bench Manual of techniques for the preparation of Immunological and Immunodiagnostic Reagents.part 1,WHO/IMM/PIR/80.1,. 3-Hudson L.& Hay F.C.(1989).Practical Immunology p:281. Blackwell Scientific Publication ,Oxford, London UK.