تشخيص التهاب الكبد الفايروسي نمط ب باستخدام تقنية تفاعل السلسلة المتبلمرة PCR

Abstract

الخلاصة الكشف عن الحامض النووي DNA للفايروسHBV-DNA )) يعد كدليل أكيد للاصابة بجزيئة الفايروس لذا استخدمت تقنية السلسلة المتبلمرة (PCR) عالية الحساسية للكشف المباشر عن تسلسل الحامض النووي للفايروس بدلا من الكشف عن المستضد السطحي (HBsAg) . تطلبت الطريقة استخدام عينات من المصل بعضها مشخص اصابتها بالتهاب الكبد الفايروسي نمط ب بطرق اخرى , وبعضها اخذت بصورة عشوائية , ثم تمت عملية عزل و استخلاص وتنقية الحامض النووي DNA من المصل ثم تمت عملية الهضم باستخدام محلول محلل (Lysis solution) وبعدها تمت اضافة الـــ Sorbent لادمصاص الــ DNA المستخلص لكي يتم مضاعفته باستخدام primer خاص بجزيئة فيروس التهاب الكبد نمط ب باستخدام جهاز الPCR ثم الكشف عن نتائج التضاعف على هلام الاكاروز . اظهرت النتائج من تضاعف DNAالفايروس (HBV-DNA ) في العينات مقارنة مع نماذج السيطرة الموجبة والسالبة دقة الفحص اذ اعطت العينات الماخوذة من المرضى المشخص اصابتهم سيرولوجيا بالمرض(HBsAg) نتائج موجبة وبعضها نتائج سالبة بتقنية PCR , اما العينات الماخوذة بصورة عشوائية فاغلبها اعطت نتائج سالبة , اذ تمت قراءة النتائج اعتمادا على وجود او غياب الحزم المتخصصة بالحامض النووي المضاعف للفيروس بعد ترحيله في هلام الاكاروز .

HBSAg , pcr , Key word : HBs DNA المقدمة تعد اصابات الكبد الفايروسي نمط ب من المشاكل الصحية الرئيسة التي تؤدي الى موت ما يقارب مليون شخص سنويا في العالم . ان العامل المسبب للمرض هو فايروس يعود لعائلة Hepadnaviridae . ان وجود المستضد السطحي للفايروس المسبب لالتهاب الكبد الفايروسي نمط ب (HBSAg ) في المصل يعد كدليل للاصابة لكن لايعطينا معلومات عن حالة تضاعف الفايروس ,كذلك عند حدوث طفرة طبيعية بمختلف انواع المطفرات في جين المستضد السطحي فلا يشخص المستضد (HBSAg ) في المصل , وكذلك بالنسبة لمستضد e لفيروس التهاب الكبد (HBeAg ) الذي يعد كدليل للتضاعف , لكن عند حدوث طفرة نقطية في مرحلة precore لفيروس HBVS ) ) فيسبب نتائج سالبة لتغير الطرز المظهرية ل HBe وبالتالي لحالة التضاعف . لذلك تم الاهتمام بقياس الحامض النووي لفايروس التهاب الكبد نمط ب (HBV-DNA ) في المصل بوساطة تقنية PCR خصوصا للاشخاص العاملين في المختبرات للتاكد من عدم اصابتهم والاشخاص المتبرعين للدم لتقليل مخاطرالعدوى وكذلك لمراقبة تضاعف الفايروس في المرضى المصابين اثناء اعطائهم العقار , وللتعرف المسبق في تشخيص الفايروس. لذا يهدف البحث الى استخدام تقنية PCR في تشخيص التهاب الكبد الفيروسي نمط ب في المصل لدقة وحساسية الفحص. الجزء العملي أ‌- جمع العينات. ب‌- عزل و استخلاص وتنقية الحامض النووي DNA من العينات (المصل ) ج- انتاج الحامض النووي ال DNA بوساطة PCR ويتطلب توفير : 1- جهاز للتحكم بدرجات حرارة التفاعل بشكل دقيق ومتتالي. 2- البادئات Primers 0 3- كميات وافرة من القواعد النتروجينية A,T,G,C ,. 4- (2,5 U ) من انزيم البوليميريز polymerase مقاوم للحرارة العالية . 5- محاليل دارئة Buffers 0 6- عوامل متممة لانزيم البوليمريز Cofactor. يكشف عن منتجات التضخيم بوساطة استخدام الترحيل الكهربائي على هلام الآكاروز Agaroe gell electrophoresis 2 %) وصبغه بصبغة Ethidium bromide لتحديد عينات HBV-DNA الموجبة والسالبة . نفذت تقنية PCR بنظام PTC-100 عند الظروف التالية : Cycle Time (min) Temperature 1 2 95 Cº 42 1 95 Cº 1 65 Cº 1 72 Cº 1 1 72 Cº Storage 10 Cº

النتائج والمناقشة تم استخلاص ومضاعفة الحامض النووي HBV –DNA لنماذج المصل الماخوذة من المرضى المصابين بالتهاب الكبد ونماذج المصل العشوائية الاخرى قيد الدراسة , وقد بينت نتائج التضخيم على هلام الاكاروز ان حجم حزمة HBV الموجبة بحدود) 470 bp ( اذ ان نتائج الPCR تعتمد على وجود او غياب حزم ال DNA المتخصصة المتضاعفة في هلام الاكاروز(2%) وان طول قطعة الDNA المتضاعفة المتخصصة بالفايروس هي (470 bp ) كما يتم مقارنتها بنموذج السيطرة الموجب للفايروس (C+ ) , و نماذج السيطرة السالبة (N) والتي هي بحدود ) 770 bp ) , اما البفر المستخدم فيجب ان لا يحوي على اي من الحزمتين المتخصصتين ( C- )واذا احتواها فهذا دليل على حدوث تلوث. كما موضح في الشكل رقم (1) كما اعطت العينات الماخوذة من المرضى المشخص اصابتهم سيرولوجيا بالمرض(HBsAg) نتائج موجبة وبعضها نتائج سالبة بتقنية ال PCR , وهذه النتائج تتفق مع ما ذكره (Ozaslan etal ,2005) و(Dursun M.etal,2005)باعتبار تواجد HBV-DNA للفيروس هو المسبب الحقيقي للاصابة بالتهاب الكبد الفيروسي , اذ اعطى الفحص السيرولوجي لل HBSAg نتائج ايجابية ل132 عينة, كانت 40 عينة منها فقط تحوي على HBV-DNA .اما بالنسبة لنتائج HBeAg فكانت جميعها ايجابية .لذلك يعتقد ان HbeAg يلعب دور حيوي في مخاطر انتقال الفيروس, فالنتائج السالبة للPCR للنماذج الموجبة ل HBSAg يعتقد انها نتيجة من فقدان HbeAg او تضاعف الفايروس viral replication. فتقنية PCR تعد من أدق الطرق حساسية لتشخيص الإصابة بالتهاب الكبد الفايروسيHBV لذلك تم الكشف عنه في هذه الطريقة , كما ان دقة النتائج تعطينا دليل على عدم وجود تلوث أثناء العمل , إذ إن الحساسية العالية التي تبديها تقنية الPCR تجعلها عرضة لإعطاء نتائج ايجابية خاطئة بسبب تلوث خارجي المنشأ فالتلوث يعد العقبة المهمة التي تواجه استخدام تقنية الPCR لغايات تشخيصية.

C N C+ 2 1 M

الشكل رقم (1) يبين نتائج الترحيل الكهربائي على هلام الاكارزو M = marker 1 , 2 = Positive Sample C+ = Positive Control N = Negative Control Sampl C- = DNA - buffer

المصادر 1-Li Min-wei , Wo Jian-er , LIU Ke-Zhau, (2005) Character of HBV (hepatitis B Virus) polymerase gene rtM z04 V/I & rt L 180 M mutation in patients with Lamivudine resistance , J.Zhejiang Univ. Sci. China, 6B(7):664-667 2- Dursun M.,Ertem M., yilmaz S., Saka G., Ozekinci T.,Simsek 5.(2005) Jpn.J.Infect.Dis.,58,15-19 . 3- Li X.,Huang Y., Song C., Zhao M., Li Y.,(2007 )Several concerns about the primer design in the universal molecular beacon real-time PCR assay & its application in HBV –DNA detection.Anal. Bioanal. Chem. 388: 979-985.