التشخيص الجزيئي لبكتريا ضمات الكوليرا بواسطة الـ PCR

Abstract

يعتبر ذيفان الكوليرا من اهم عوامل الضراوة لبكتريا الكوليرا المسببة للاسهال المائي . ولان الكشف الروتيني عن بكتريا الكوليرا المنتجة للذيفان والمتضمن زراعة البكتريا على الوسط الزرعي واجراء الاختبارات المناعية والكيموحيوية تستهلك جهدا ووقتا يتعدى ثلاثة ايام فقد تم في هذا البحث تصميم بادئات خاصة لجين CTXB لغرض الكشف عن بكتريا الكوليرا في النماذج المائية . ان تقنية الـ PCR هي طريقة بسيطة وسريعة وحساسة جدا بحيث انها تعطي ملايين النسخ من الـ DNA من نسخة جين واحدة خلال ساعات قليلة ، وتستخدم بعدة جوانب ولمختلف المجاميع مثل النباتات والحيوانات والاحياء المجهرية . في بحثنا هذا لوحظ ان اضافة كمية اضافية من الملح MgCl2 حسن من اداء الفحص .

المفتاح Diagnosic of Vibrio cholerae by PCR , detection of Vibrio cholerae by PCR , Identifiction of Toxigenic Vibrio cholerae by PCR

المقدمـة يعتبر جنس الكوليرا من الاجناس الممرضة والمرتبطة تسميتها بمرض الاسهال المائي . بكتريا الكوليراعصيات سالبة لصبغة كرام تنمو على وسط خاص هو (TCBS) وبدرجة حموضة هي PH=8 ، كما تعتبر بكتريا الكوليرا كائن مجهري ممرض وبائي على مستوى العالم وخصوصا دول العالم الثالث ومن ضمنها العراق . ان الكشف السريع والدقيق لهذه البكتريا في النماذج المائية والمرضية مهم للصحة العامة . وحيث ان الطرق الروتينية من العزل والزرع للبكتريا تأخذ وقت لذا يعتمد الان على فحص التفاعل التسلسلي المتضاعف PCR للتشخيص كفحص دقيق وسريع. ان عملية الـ PCR يمكن ان تنجز بواسطة دورات منفصلة وكل دورة يمكن ان تكون سبب رئيسي لتضخيم الـ DNA الهدف لعدة مرات لذلك فأن تضخيم الـ DNA الهدف يكون بشكل اسي . وفي كل دورة من دورات هذه التقنية تزداد اعداد قطع الـ DNA حيث يمكن الكشف عن البكتريا او الفيروس في المختبر بطريقة التضخيم لتعاقب مختار من الحوامض النووية اما في الـ DNA او الـ RNA .

الجزء العملي البكتريا : تم تنمية بكتريا الكوليرا على وسط (TCBS) agar Thiosulfate – Citrate -Bile - Salt-Sucrose Agar وتم الحضن بدرجة 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة . استخلاص الـ DNA : تم استخلاص الـ DNA حسب العدة المجهزة من قبل شركة (Sacace Biotechnologies) تصميم البادئات : تم تصميم بادئات خاصة لتضخيم جين CTXB (Gene bank accretion number) (AF390572) حسب الجدول (1) وتم ارساله لشركة Alpha DNA Company Canada لتصنيعه . جدول يمثل بادئات تضخيم جين CTXB لبكتريا الكوليرا :

Primers Primers sequence(5_- 3_) Nucleotide position Amplicon size(bp) Forward TGAATTATGATTAAATTAAAATTTG 941-967 391 Reverse TTTATATCTTAATTTGCCATACTAA 1306-1331

فحص التفاعل التسلسلي المتضاعف PCR: تضمن تفاعل فحص التفاعل التسلسلي المتضاعف مايلي : 1. 11µl من عالق البكتريا . 1. 25µl Go Taq * Green master (promega,CA) . 2. (1.5 µl) 25 * m mol MgCl2 3. (2 µl) 10 pcomol of each primer 4. 3 µl ماء مقطر . وتم التضخيم بجهاز (Eppendorf) Mastercycler وحسب البرنامج : 95C◦ – 5 min – 1X 95C◦ – 1 min 56C◦ – 1 min – 40X 72C◦ – 1 min 72C◦ – 10 min – 1X تم ترحيل ناتج الـ PCR على هلام الاكاروز ذو تركيز 1.5% والكشف عن النتيجة تحت الاشعة فوق البنفسجية بعد التصبيغ بالاثيديوم برومايد . المناقشة و الاستنتاج بعد اجراء عدد من التجارب لضمان افضل تضخيم للجين وبدون بادئات اخرى وجد ان قراءة جهاز المطياف الضوئي للـ DNA بدرجة 260 ◦ بلغت 1.7 وهي نسبة جيدة حيث ان افضل قراءة تتراوح بين 1.6-1.9 . كما وجد ان افضل تركيز للملح كان (5 µl of 25 m mol MgCl2 ) وافضل درجة حرارة ارتباط هي 56 درجة مئوية (شكل (1)) حيث وجد بأن زيادة تركيز الملح كثيرا يسبب انتاج بادئات اخرى لذا تم عمل تقييس لاختبار افضل تركيز . * m mol( ملي مول )

الشكل (1) الترحيل الكهربائي لناتج الـ PCR على الاكاروز بتركيز (1.5%) لجين CTXB المستخلص من بكتريا ,MgCl2 2µl(2), MgCl2 1µl (1)V.cholerae(Inaba) MgCl2 5µl(5), MgCl2 4µl (4), MgCl2 3µl (3) (M) يمثل 100 bp – 1000 bp DNA Marker

تم عمل الـ PCR على بكتريا قريبة من الكوليرا وهي ,E.coli ,Aeromonas SP. V.cholera NAG ولوحظ ان الفحص هو خاص لبكتريا الكوليرا كما موضح في الشكل رقم (2) وليس غيرها لذا من الممكن استخدام هذا الفحص للكشف عن بكتريا الكوليرا خلال وقت قصير لايتجاوز الثلاث ساعات .

الشكل (2) الترحيل الكهربائي لناتج الـ PCR على الاكاروز بتركيز 1.5% لجين CTXB 100 bp- 1000 bp DNA Marker:M V.cholera (Inaba).1 2. E.coli 3. Aeromonas SP. 4.AVG V.cholera

Refrences 1. Kapley, A. And Purohit, H. J. (2001) Detection of etiological agent for cholera by PCR protocol. Med Sci Monit.,7,242-245 . 2. Bonacum, j.; Stark, J. and Bonwich E. (2002). PCR methods and approaches, in Techniques in molecular systematics and evolution. Edited By Rob DeSalle, Gonzalo Giribet, Ward Wheeler,. Published by Berkhauser verlag, switzerland . 3. Tereza M.; Razzolini, P.; Di Bari, M.; and Sanchez P. And Sato, M. (2008) .Aeromonas detection and their toxins form drinking water from reservoirs and drinking fountains. Journal of Water and Health, 6,117-123 .