التشخيص الجزيئي لبكتريا البروسيلا بواسطة الـ PCR

Abstract

الخلاصــة لبكتريا البروسيلا عدة انواع ، اخطرها هو الـ Brucella abortus المسؤول عن اجهاض الابقار والماشية مما يسبب خسائر اقتصادية كبيرة في كثير من البلدان وايضا اصابة الانسان مسببة له مرض حمى مالطا . ولما كانت الفحوصات السيرولوجية المستخدمة غير دقيقة حيث أنها يمكن ان تعطي نتائج موجبة كاذبة او نتائج سالبة كاذبة لذا تم اللجوء الى فحص الـ PCR المعروف بسرعة ودقة تشخيصه للبكتريا . صممت بادئات مسؤولة عن مضاعفة DNA للـ Brucella abortus فقط حيث تم مقارنة النتائج مع نوع ثاني من البروسيلا هو melitensis Brucella وكذلك بكتريا مختلفة تعطي في بعض الاحيان نتائج موجبة كاذبة في الفحوصات السيرولوجية مع البروسيلا وهي E.coli:0:157 .

المفتـاح : Diagnosic of Brucella by PCR , detection of Brucella by PCR.

المقدمـة لما كان مرض حمى المالطا من الأمراض المنتشرة بدرجة كبيرة في العالم وكانت الفحوصات المستخدمة للكشف عن هذا المرض غير دقيقة 100% بالإضافة الى الوقت والجهد الكبير الذي تحتاج اليه هذه الفحوصات والفحوصات الموجبة الكاذبة التي تعطيها مع أنواع مختلفة من البكتريا لهذا كان من الضروري أيجاد طريقة دقيقة وسريعة لغرض التشخيص وكانت هذه الطريقة هي فحص التفاعل التسلسلي المتضاعف PCR . ان عملية الــ PCR يمكن ان تنجز بواسطة دورات منفصلة وكل دورة يمكن ان تكون سبب رئيس لتضخيم الــ DNA الهدف لعدة مرات لذلك فأن تضخيم الــ DNA الهدف يكون بشكل اسي. وفي كل دورة من دورات هذه التقنية تزداد اعداد قطع الــ DNA حيث يمكن الكشف عن بكتريا البروسيلا او أي نوع اخر او فيروس في المختبر بطريقة التضخم لتعاقب مختار من الحوامض النووية .

الجزء العملي البكتريا : تم تنمية بكتريا البروسيلا وتنشيطها على وسط tryptic Soya Broth وتم الحضن بدرجة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ومن ثم زرعها على وسط tryptic Soya Agar وبنفس ظروف الزرع. استخلاص الـ DNA : تم استخلاص الـ DNA حسب العدة المجهزة من قبل شركة (Sacace Biotechnologies)

تصميم البادئات : تم تصميم بادئات خاصة لتضخيم الجين المسؤول عن تكوين البروتين الخارجي للبروسيلا(Gene bank accretion number) (U26438) حسب الجدول ادناه وتم ارساله لشركة Alpha DNA company Canada.

بادئات تضخيم الجين المسؤول عن تكوين البروتين الخارجي للبروسيلا Amplicon size (bp) Nucleotid position Primers sequence (5-3) Primers 186 2110-2130 GCGCTC AGGCTG CCGACGCAA Forward 2295-2276 CAT TGCGGT CGGTAc CGGAG Reverse

فحص التفاعل التسلسلي المتضاعف PCR: تضمن تفاعل فحص التفاعل التسلسلي المتضاعف مايلي : 1. 10µl من عالق البكتريا . 2. 22 µl GoTag Green Master (promega, CA) . 3. (2µl) 10 picomol of each primer 4. (0.06 µl) Imm MgCl2 . 5. 3 µL ماء مقطر. وتم التضخيم بجهاز (Eppendorf) Mastercycler وحسب البرنامج : 95C◦ – 5 min – 1X 95C◦ – 30 sec 54C◦ – 90 sec – 40X 72C◦ – 90 sec 72C◦ – 6 min – 1X تم ترحيل ناتج الـ PCR على هلام الاكاروز ذو تركيز 0.8% والكشف عن النتيجة تحت الاشعة فوق البنفسجية بعد التصبيغ بالاثيديوم برومايد .

المناقشة و الاستنتاج لما كانت بكتريا Brucella abortus المسببة للاجهاض بالابقار وبالتالي خروجها مع حليب الابقارلتصيب الانسان مسببة له مرض حمى المالطا. صممت هذه البادئات لتضخيم الجين المسؤول عن تكوين البرويتن الخارجي للبروسيلا وهي متخصصة لل Brucella abortus حيث تم مقارنتها مع بكتريا من نفس صنف البروسيلا وهي Brucella melitensis بالاضافة الى بكتريا قريبة وفي بعض الاحيان تعطي نتيجة موجبة كاذبة في الفحوصات السيرولوجية وهي بكتريا E.coli 0:157 وكانت النتيجة واحدة وهي تضخمDNA الــ Brucella abortus كما في الشكل رقم (1).

الشكل (1) الترحيل الكهربائي لناتج الـ PCR على الاكاروز بتركيز (0.8% ) للجين المسؤول عن تكوين البروتين الخارجي للـ Brucella abortus .

M –DNA Marker (1000 bp) 1- Brucella abortus 2- Brucella melitensis 3- E.coli :0:157

Refrences : 1. Corbel, M.J. (1997): Brucellosis an overview. Emerg Infect. Dis.93, 213-221. 2. Romero, C., Gamazo, C. , Pardo, M., et al. (1995): Specific detection of Brucella DNA by PCR. J. CLIN. Microbiol., 33, 615-617. 3. Baily, G.G., Krahn, J.B., Drasar, B.S., et al. (1992): Detection of Brucella melitensis and Brucella abortus by DNA amplification. J. Trop. Med. Hyg., 95, 271-275 .