تحضير عدة الكشف عن أضداد سموم المكورات العنقودية في أمصال الأشخاص المصابين

Abstract

الخلاصة تم تحضير عدة الكشف عن سموم بكتيريا المسبحيات نوع Streptolysin-O في امصال الاشخاص المصابين ببكتيريا group AB-hemolytic Streptococci والذي يؤدي الى افراز اجسام مضادة خاصة ضد سموم هذه البكتيريا ومنها antistreptolysin-O وكمية الاجسام المضادة الموجودة في مصل الاشخاص المصابين يدل على درجة الاصابة بهذا النـوع من البكتريا أو السموم. وتحتوي العدة المحضرة على معلق من حبيبات البولي ستيرين ASO Latex Reagent مغطاة بسموم البكتريا Streptococcal والمحلول القياسي الموجب ASO Positive Control والمحلول القياسي السالبASO Negative Control . ومبدأ الفحص يعتمد على التفاعل او التلازن بين سموم بكترياStreptococcus والمغطاة على حبيبات اللاتكس Latex Beads of polystyrene ذو قطر 0.12 µm والاضداد Antibodies الخاصة ضد سموم هذه البكتريا والموجودة في مصل المريض ويزداد التلازن agglutination بزيادة نسبة الاجسام المضادة وبالعين المجردة.

Key word: Preparation of ASOT kit

المقدمة المكورات العقدية (المسبحيات) Streptococcus وهي بكتريا موجبة لصبغة غرام بيضوية الشكل تتراوح أقطار خلاياها بين (0.9-0.7) مايكروميتر . بعض انواعها ممرض للانسان مثل S.pyogenes, S.pneumonie والبعض الاخر يوجد طبيعيا Normal flora في الفم والامعاء عند الانسان. وتشير اغلب الدراسات الى ان بكتريا Streptoccus Pyogenes هي المسبب لمرض التهاب اللوزتين ويعتمد تشخيصه على قياس عيارية الاجسام المضادة لمستضدات هذه البكتريا Anti-streptolysin O(ASO). من أعراض المرض : تورم اللوزتين، فقدان الشهية ، توعك في الصحة ،الاجهاد. وقد ترتفع درجة حرارة الجسم الى 40˚ م مع صعوبة البلع والم في اللوزتين وقد يمتد الالم الى منطقة الاذن وقد يحصل تضخم في اللهاة Uvula والحنك Palate . ومن مضاعفات المرض تسمم ،التهاب الجيوب الانفية ، التهاب الاذن الوسطى ،ذات الرئة ، روماتيزم القلب ، الروماتيزم ،التهاب الكلية . وتعود قابلية العديد من المسبحيات على تحليل كريات الدم الحمراء Red Cells Blood لافرازها انزيم الستربتولايسين . وتقسم هذه البكتريا الى: 1. الانواع المحللة للدم نوع بيتــا β-haemolytic species تنتج المسبحيات المحللة للدم بيتا محيطا واسعــــا من التحلل الدموي الكامل. 2. الانواع المحللة للدم نوع الفــا α-Haemolyte species تنتج مادة محللة للدم تسمىα-haemolysin والتي تكون لها القابلية على اختزال خضاب الدم Haemoglobin الاحمرالى الميثوغلوبين الاخضر اللون methoglobin. 3. الانواع المحللة للدم نوع كاما – haemolytic δ.

الجزء العملي أولا" : المواد وطرائق العمل Material and methods ‌أ) تحضير محلول الدارئ (Glycin buffer) (0.5 M) وذلك بأذابة  الكلايسين 14gm Glycin  هيدروكسيد الصوديوم Sodium Hydroxide 0.7 gm  كلوريد الصوديوم 17 gm Sdium chloride  ازيد الصوديوم 0.1gm Sodium azid تذاب المواد اعلاه في الماء المقطر وتعدل حامضية المحلول لتصل الى أس هيدروجيني PH 8.2 . ثم يكمل الحجم الى 1000 L. ‌ب) محلول اللاتكس ASO Latex Reagent. تغسل مادة اللاتكس 1 ml ذو قطر 0.12 µm بأضافة 50 مل من محلول دارئ الكلايسين وبأستخدام جهاز الطرد المركزي المبرد وبسرعة 1500 (دورة /دقيقة) ولمدة 20-15 دقيقة ويعلق الراسب بأضافة 25-20 مل من المحلول الدارئ الكلايسين ويضاف له محلول المستضد Streptolysin-O بواقع 400 µl (protein concentration < 30 mg/ml) ثم يخلط بجهاز Shaker ويترك بدرجة حرارة الغرفة ويرسب المحلول بجهاز الطرد المركزي المبرد بسرعة 15000 (دورة/ دقيقة) لمدة 20-15 دقيقة بعدها نتخلص من الرائق ويضاف الى الراســـب محلول الكلايسين الذي يحتوي على 0.1 % من البومين المصل البقري ويحفظ في الثلاجة. جـ ) مصل السيطرة الموجب Positive Control: تم الحصول على نماذج سيطرة موجبة من اشخاص مصابين بـ Sterptococcus pyogenes بأعمار (15-5) سنة . د ) تحضير مصل السيطرة السالب Negative Control : تم تحضيرها من امصال اشخاص اصحاء . ثانيا" : طريقة الفحص 1. يتم جلب المحاليل والنماذج المرضية والامصال في درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها . 2. يتم وضع قطرة واحدة ( حوالي 40 مايكروليتر ) من المصل الموجب للعدة في الحفرة الاولى لسلايد العدة . ثم يوضع قطرة واحدة (40 مايكروليتر ) من المصل السالب للعدة في الحفرة الثانية لسلايد العدة . بعدها يتم وضع قطرة من مصل المريض( 40) مايكروليتر الغير مخفف في الحفرة الثالثة من سلايد العدة ، تتم هذه العملية باستخدام Serological Pipette . 3. يتم مزج محلول اللاتكس بعدها يضاف قطرة من هذا المحلول بواقع (40 ) مايكروليتر الى كل حفرة من سلايد العدة 3,2,1 . 4. يتم مزجها جيدا" بواسطة Stirrings Sticks لمدة ثلاث دقائق وتقرأ تحت إضاءة جيدة . 5. النتيجة الموجبة ظهور التفاعل محبب نتيجة التصاق الاضداد الموجودة في مصل المريض أو مصل العدة الموجب مع سموم البكتريا المحملة على حبيبات اللاتكس . وتقرأ عياريــــــة الاصابة مـــــــــــــــع مدة التفاعل وشدة الاصابة تتدرج Iu/ml 1:200 ، Iu/ml 1:400 ، Iu/ml 1:800 وأقل من Iu/ml 1:200 يعتبر نتيجة سالبة . 6. النتيجة السالبة يكون مستحلب اللاتكس صافي وخالي من التلازن أي التفاعل .

اجرى التقييم لعمل العدة المحضرة في المركز على 60 نموذج (12) منها موجب و (48) نموذج سالب وتم مقارنة النتائج مع عدة اجنبية منتجة من قبل شركة Spinreact الاسبانية والمستخدمة في مختبرات المستشفيات الحكومية والاهلية وكما في الجدول ادناه :

Spinreact AL-RAZI Total ــــ + Total ــــ + 12 0 12 12 0 12 ASOT+ 48 48 0 48 48 0 ASOT- 60 48 12 60 48 12 Total

المناقشة والاستنتاج أظهرت النتائج حساسية عالية للعدة المصنعة في مركز الرازي مقارنة" مع العدة الأجنبية من قبل شركة Spinreact الاسبانية وهذا يعتمد بدوره على عوامل لإنجاح تصنيع العدة من اختيار قطر حبيبات اللاتكس التي تحمل عليها سموم البكتريا لخلق المساحة الكافية لتفاعلها مع الأضداد الموجودة في مصل المريض عند خلطها معا" عند الفحص وكذلك عامل درجة حرارة الغرفة التي يحدث فيها الفحص حيث يجب أن تكون مثالية ولهذا توضع الأمصال والمحاليل في درجة حرارة الغرفة قبا استخدامها بالإضافة إلى صلاحية المواد التي أستخدمت في تحضير محاليل العدة . وقد اجريت الفحوصات كل للتأكد من ثباتية نتائج العدة وكانت النتائج جيدة ولم تلاحظ أي تغييرات في نتائج العدة أي بمعنى نتائج كاذبة false results .

المصادر 1. Collee, J.G.; Fraser, A.G.; Marrmion, B.P.and Simmons, A.S. (1996). Practical Medical Microbiology. 14th ed., Chuachill Livingstone. 2. Brooks, G.F.; Butel, J.S. and Morse, S.,(1998)., Medical Microbiology, 21sted., Appleton and Lang, California. 3. Jolly, H.(1981). Diseases of Children., 4th ed .,ELBS and Black well Scientific Publication, Oxford.