التشخيص الجزئيي لخمائر Candida Albicans بواسطة PCR

Abstract

تـم في هذا البحث تضخيم قطعــة مــن الـ DNA طولهــا * 344 bp علـى الجين*Alpha Integrin-Like Proton (∝INTIP) بواسطة بادئات (Primers) متخصصة لهذا الجين وتم الفحص علـى نمـاذج مرضيـة بأستخدام خمائر مختلفة مثل Candida formata , and and Candida krusei Candida albicansوتم اختبارها بـطريقة الــتفاعل السلسلي المــتضاعفPolymerase Chain Reaction (PCR) وقد تبين بان النتائج كانت موجبة فقط بالنسبة الى Candida albicans حيث حصل تضاعف لـ DNA هذا النوع من الخمائر ولم يحدث تضاعف للانواع الاخرى من الخمائر المستعملة في هذا البحث . واظهر هذا الفحص بأن طريقة الـ PCR تكون متخصصة وسريعة اكثر مما هو الحال في الطريقة الروتينية المستعملة وهي طريقة الزرع والتي تحتاج الى ايام لغرض تحديد نوع الفطر .

المفتاح Diagnosic of Candida albicans by PCR, Detection of Candida albicans by PCR

المقدمة الـ Candida هي خمـائر توجد بصورة طبيعيـــة فـي جسم الإنسان (Normal flora) ويعتبر جنس Candida albicans أهم أجناس الـ Candida التي تسبب الأمراض للإنسان حيث يوجد هذا الجنس في الغشاء المخاطي وفي الجزء العلوي للجهاز التنفسي والجهاز المعدي والجهاز التناسلي الأنثوي . تعتبر هذه الخمائر من الممرضات الانتهازية وتكون واسعة الانتشار في الاطفال حديثي الولادة وكذلك المرضى المصابين بداء السكري والايدز . لا ينتقل هذا المرض من شخص الى آخر او بتعبير آخر لاتوجد عدوى في حالة الاصابة بهذه الخمائر ولكن الاصابة تحدث عند ضعف الجهاز المناعي للانسان. ومن الأسباب الاخرى التي تسبب الإصابة ، تغير درجة الحموضة (pH) .وتسبب هذه الخمائر عدة أمراض منها التهاب اللثة (thrush) والتهاب المهبل(vaginitis) وداء المخاط الجلدي المزمنMucoculeneous Candidiasis Chronic . * bp زوج قاعدي حيث ان الجينات يقاس طولها بالزوج القاعدي.

الجزء العملي تم زراعة خمائر Candida formata , Candida kruse and Candida albicans على الوسط الخاص بتنمية الخمائر وهو وسط Sabouroud Dextrose Agar . استخلاص الـ DNA : تم استخلاص الـDNA باتبــــاع طريقة Holm et al. واستخدمت العـــدة المجهزة من قبل شركة (Sacace Biotechnology ) لهذا الغرض.

تصميم البادئات: تم تصميم بادئات خاصة لتضخيم الجين المسؤول عن integrin- like protein (∝INTIP) alpha الخاص بخمائر الـ Candida albicans . Accesion number U 35070 و كما مبين في الجدول ادناه Primers Primers sequence (5-3) Nucleatid Position Anplicon size Forword 5’-AGC CAC AAC AAC AAC AAC AAC TCT -3’ 401-424 344 Reverse 5’ – TTG AGA AGG ATC TTT CCA TTG ATG -3’ 721 – 744

فحص التفاعل السلسلي المتضاعف PCR يتضمن فحص التفاعل السلسلي المتضاعف تحضير ما يلي : 1. 2.5µl من البفر الخاص بالـ PCR ذو رقم هيدروجيني 8.3 . 2. * 100 ng من DNA خمائر Candida albicans and Candida Krusei ، Candida famata. 3. 200 µM من *dNTP في كل اختبار . 4. 1µmol of each primers . 5. 0.5*U Taq polymerase. 6. 25µL من الماء المقطر . *ngنانوغرام. *dNTP (deoxy riboNucleoside Triphosphate ). *U وحدة دولية = 0.2 مايكروليتر وتم التضخيم بجهاز (Master cycler Eppendorf) و حسب البرنامج:- 1X- 92 C°-3min denaturation 92 C°-1min denaturation 30X- 55 C°-1min annealing 72 C°-1min extension 1X- 72 C°-10min Complete extension

تم الكشف عن ناتج الـ PCR بواسطة جهاز الترحيل الكهربائي على هلام الاكاروز بتركيز 2% بأستعمال TAE buffer بعد التصبيغ بصبغة الاثيديوم برومايد .

المناقشة والاستنتاج يوضح الشكل (1) تخصص البادئات المستخدمة للكشف عن الخمائر الممرضة Candida albicans حيث نستدل من هذه النتائج بان هذا النوع من الخمائر هو الوحيد الذي يكوّن جين ∝INTIP و لكون هذا النوع من الخمائر مهمة من الناحية المرضية حيث انها تسبب العديد من الامراض لذا فيعتبر تشخيصها الدقيق و السريع من الامور المهمة لغرض اعطاء العلاج الملائم و بالسرعة الممكنة .

شكل (1) الترحيل الكهربائي لناتج الـ PCR على الاكاروز بتركيز 2% لجين ∝Integrin – like protein

DNA marker (100-1000 bp M) 1. Negative control . 2. Positive control . 3. Candida albicans. 4. Candida krusei. 5. Candida famata.

References 1. Fox, J.L. 1993. Fungal Infection rates are increasing . ASM. News. 59, 515-518. 2. Mannarelli, B.M. & C.P. Kurtzman. 1998. Rapid identification of Candida albicans and other human pathogenic yeasts by using short oliyonucleotides in a PCR . J.Clin. Microbiol 36, 1634 – 1641 . 3.Wilcox, C.M. & M.W. Karowe. 1994 . Esophageal infections: etlology, diagnosis and management. Gastroenterologist 2, 188-206.