| الملخص | الخلاصة
حضرت عدة لتشخيص مرض حمى مالطا (البروسيلا( IgGمختبريا" باستخدام تقنية التفاعل المناعي الانزيمي . (ELISA) اعتمدت هذه الطريقة على تفاعل الضد الموجود في مصل دم المريض مع المستضد (antigen) وهي بكتريا البروسيلا المثبتة على صفيحة المعايرة باستخدام الانزيم المقترن Enzyme conjugate واضيفت مادة الاساس و حدث تغير في اللون الذي تقاس شدته باستخدام جهاز الاليزا فيعطي نتيجة الفحص الموجبة او السالبة.
Key words: ELISA , Brucellosis , Brucella IgG.
المقدمة
البروسيلا بكتريا سالبة لصبغة كرام لاتحتوي اسواط ولا تكون ابواغ. اكتشفت من قبل الدكتور David Bruce عام 1887عندما استطاع عزلها من طحال احد الجنود المصابين بحمى متموجة. هناك اربعة انواع من هذه البكتريا التي تصيب الانسان وهي Brucella melitensis , Brucella abortus, Brucella canis ,Brucella suis, تسبب هذه البكتريا داء البروسيلوسز Brucellosis الذي يتميز بارتفاع درجة حرارة الجسم بصورة غير منتظمة (حمى متموجة) او حمى مالطا. تنتقل هذه البكتريا من الحيوانات المصابة الى الانسان عن طريق الاتصال المباشر او تناول اغذية ملوثة بهذه البكتريا مثل الحليب ومشتقاته غير المبسترة. لذلك فان طريقة دخول البكتريا عن طريق الجروح او العين او عن طريق الجهاز الهضمي. تنتقل البكتريا داخل الجسم من الدم الى العقد اللمفية ومن ثم الى جميع اعضاء الجسم فتظهر اعراض المرض طبقا" للعضو المصاب مثل تضخم الكبد او الطحال، التهاب المفاصل، التهاب شغاف القلب.
اكثر انواع البكتريا انتشارا" هي Brucella. abortus ، بينما المتسبب عن Brucella.melitensis يكون بشكل بؤر في المناطق التي تكثر فيها الاغنام والماعز. يصاب بهذا المرض الاشخاص الذين هم بتماس مباشر مع الماشية مثل العاملين في المجازر والاطباء البيطريين اوالعاملين في المختبرات.
تستخدم عدة طرق للكشف عن الاصابة بالمرض مختبريا" مثل التلازن على الشريحة باستخدام كاشفRose Bengal اوفحص تثبيت المتمم ، او زرع نموذج من الدم على وسط خاص للتحري عن بكتريا البروسيلا. الا ان ادقها هو استخدام تقنية التفاعل المناعي الانزيمي Enzyme Linked Immuno Sorbant Assay (ELISA) التي تعتمد على وجود الاضداد(antibodies) في مصل الاشخاص المصابين والتي تتفاعل مع المستضدات (antigens) وهي بكتريا البروسيلا الموضوعة في حفر صفيحة المعايرة micro titer plate حيث يتكون معقد (Antigen-Antibody) يضاف اليه المقترن الانزيمي Enzyme conjugate ثم المادة الحليلةsubstrate فيتكون لون تتناسب شدته مع كمية الاضداد الموجودة في مصل الشخص المصاب و تقرا باستخدام جهاز الاليزا.
الجزء العملي
استخدمت بكتريا Brucella abortus في طلاء حفر صفيحة المعايرة باستخدام داريء الطلاءcoating buffer المكون من بيكاربونات وكاربونات الصوديوم (PH=9.6) الحاوي على (3%)من البومين المصل البقري ثم حفظت بدرجة 4ºم لحين الاستخدام،حضر محلول المعايرة A) ) من مصل ارانب خالي من الاضداد الخاصة بالبروسيلا وكذلك محلول المعايرة القياسي (B) من مصل مرضى مصابين بالبروسلا ،محلول المعايرة الموجب الضعيف (C) ومحلول المعايرة (D).
اضيفت لهذه المحاليل مادة حافظة وحفظت بقناني زجاجية سعة (5) مل بدرجة (4)ºم .
استخدم المقترن الانزيمي Enzyme Conjugate المحضر من قبل شركة Demediatec Diagnostic .
حضر محلول المادة الاساس باضافة (10) ملغم من مادة Tetramethyl benzidine الى(500) مل من دارىء الفوسفات PBSوحفظ في قناني معقمة .
حضر محلول الايقاف Stop solution من حامض H2SO4 بتركيز (0.5 ) وحضر محلول التخفيف باضافة (50) ملغم من البومين المصل البقري الى لتر من دارىء الفوسفات ، كما حضر محلول الغسل Washing buffer باضافة (20)مل من مادة Tween 20 الى لتر من PBS ، حفظت جميع المحاليل بقناني زجاجية معقمة بدرجة 4ºم .
فحص (20) نموذج مرضي على العدة المحضرة في المركز انفا" مقارنة مع عدة اجنبية تحتوي على محاليل قياسية مستخدمة في المختبرات الحكومية والاهلية.
استخدم جهاز قراءة الاليزا ELISA Reader نوع Biotech والمتصل بجهاز حاسوب لرسم المنحني البياني.
المناقشة والاستنتاج
من خلال استعراض جدول النتائج المستحصلة من اختبار العدة المحضرة في المركز ومقارنتها مع عدة اجنبية مستخدمة في المختبرات الحكومية والأهلية اظهر الجدول رقم (1) تطابق النتائج كما إن مستويات الاجسام المضادة في العينات التي فحصت اظهرت مستويات عالية في ( 14) نموذج واعتبرت نتائج موجبة فيما اظهر النموذج رقم (7) ان تركيز الأجسام المضادة = 10.1)u/ml) وهو بين (8-12 ) لذلك توصي الشركات المنتجة لهذه العدة في مثل هذه الحالات بإعادة الفحص بعد اسبوعين باستخدام نموذج مصل حديث Fresh sample وإذا أعطى نفس النتيجة فيعتبر سالباً(5).
فيما أظهرت خمسة نماذج مستويات اقل من 8)U/ml ) فاعتبرت نتائج سالبة .
ومن خلال الاختبار( t.test) الاحصائي لمقارنة العدتين فان الاحتمالية p))<0.05 اي عدم وجود فرق معنوي في النتائج للعدتين وان معدل الارتباط بينهماr) )=ٌ0.999 وبذلك تكون نتائج العدة المحضرة مطابقة لنتائج العدة المستوردة .
جدول رقم (1)((النتائج المستحصلة باستخدام العدة المحضرة في
مركز الرازي للبحوث وانتاج العدد التشخيصية مقارنة مع عدة اجنبية))
العدة الاجنبية العدة المحضرة في المركز
النتيجة U/ml رقم النموذج النتيجة U/ml رقم النموذج
- 4.3 1 - 4.3 1
- 5.2 2 - 5.2 2
+ 14 3 + 14 3
+ 14.9 4 + 14.9 4
- 2.6 5 - 2.6 5
+ 16.5 6 + 16.5 6
equivocal 10.1 7 equivocal 10.1 7
+ 14.8 8 + 14.8 8
+ 18 9 + 18 9
+ 20 10 + 20 10
+ 21 11 + 21 11
- 6.2 12 - 6.2 12
+ 12.6 13 + 12.6 13
+ 12.9 14 + 12.9 14
+ 18.2 15 + 18.2 15
+ 13.2 16 + 13.2 16
+ 19.1 17 + 19.1 17
- 7.8 18 - 7.8 18
+ 20 19 + 20 19
+ 13 20 + 13 20
+ 14 نتيجة موجبة
- 5 نتائج سالبة
Equivo 1 نتيجة مبهمة
المصادر
1 –Araj, G.F.A.R.; Lulu, M.Y. Mustafa, and M.I. Kateeb,1986, " Evaluation of ELISA in diagnosis of acute and chronic brucellosis in human beings"
Journal of Hygiene (97) 457-469.
2-Robichaud S.; libman M. (2004) Prevention of laboratory –acquired brucellosis"clin .infect Dis 38(12)pp,119-22
3-Atluri V.L.,Javier, M.N.,and Dejony , A.(2011) Interaction of the human pathogenic brucellosis , Annual Review of microbe 65; 523-541 | en_US |
