تحضير عدة صبغة كرام

Abstract

الخلاصة تعتبر صبغة كرام من الصبغات التفاضلية وهي طريقة مثالية للتفريق بين انواع البكتريا المسببة للامراض . وعلى اساس استجابة البكتريا لهذه الصبغة سوف تقسم البكتريا الى مجموعتين هما : بكتريا موجبة لصبغة كرام والاخرى سالبة للصبغة . تستعمل صبغة كرام (التي سميت نسبة الى العالم (Hans Christian Gram (1853-1938) لهذا الغرض اذ تخضع البكتريا بعد تثبيتها على الشريحة الى صبغة الكرستال البنفسجية crystal violet ثم محلول اليود Iodin Solution و يضاف مذيب عضوي مثل الايثانول الذي يستعمل للقصر ثم صبغة ثانوية اخرى تكون عادة مغايرة للون الصبغة الرئيسة وتستخدم عادة صبغة السفرانين Safranin الحمراء . البكتريا الايجابية لصبغة كرام تكون بنفسجية في حين تكون البكتريا السلبية لهذه الصبغة حمراء اللون . ان صبغة كرام تساعد كثيرا في تشخيص و دراسة البكتريا وتحديد اشكالها اذ يصعب ملاحظة الكائنات الشفافة والمتحركة و دراستها بدون صباغتها . تعتبر هذه الصبغة مفتاح البدء بعملية التشخيص وطريقة سريعة جدا و اسرع من زرع البكتريا الذي يتطلب الانتظاراذ تستخدم في المختبرات الحكومية والاهلية وكذلك المستشفيات لذا اقترح هذا البحث لاهميته الكبيرة اذ يمكن ان يدخل في عملية انتاج هذه الصبغة المهمة ويمكن توفيرها محليا وبأسعار مناسبة جدا أفضل من استيرادها وبالعملة الصعبة.

Key Word: Preparation Of Gram Stain. , Gram Stain Solution.

المقدمـة ان الفحص البسيط للاصباغ الجرثومية يعتمد على حقيقة مفادها : ان الجراثيم تختلف عن المحيط المتواجدة فيها كيمياويا وفيزياويا ، وكذا الحال في طرق اصطباغ هذه الجراثيم بعضها عن البعض الاخر . لهذا تعتبر صبغة كرام احدى الصبغات التي تستعمل على نطاق واسع للتفريق مابين الجراثيم التي تصطبغ باللون البنفسجي القاتم هي ((Gram +ve bacteria والتي تصطبغ باللون الوردي هي (Gram -ve bacteria) . يعتبر التصبيغ ميكانيكية تستعمل للمساعدة في تفريق البكتريا بواسطة قدرتها على الاستجابة للصبغة حيث ان صبغ البكتريا يساعد في رؤيتها بوضوح تحت المجهر . ان صبغة كرام تعتمد على الخصائص الكيميائية والفيزيائية لجدار البكتريا اذ يكشف عن الببتيدوكلايكان الموجودة كطبقة سميكة في البكتريا الموجبة لصبغة كرام اذ يصبح لونها بنفسجي/ ازرق بينما في السالبة لصبغة كرام يصبح لونها احمر / وردي. ومن الناحية الطبية ، تجرى صبغة كرام على سوائل الجسم body fluid وعند اخذ الخزع من الاعضاء biopsy عند احتمال وجود اصابة بكتيرية مرضية .

طريقة العمل : حضرت صبغة كرام كما يأتي: (1) مسحوق صبغة الكرستال فايوليت Crystal Violet: يذاب (2gm) من مسحوق Crystal Violet في (20ml) ايثانول ثم يضاف (0.8) امونيوم اوكزاليت للمحلول السـابق . يترك المحلول لمدة 24 ساعة في الحاضنة عند درجة حرارة 25°C . يكمل المحلول السابق الى (80ml) بالماء المقطر ويترك 24 ساعة اخرى في الحاضنة عند نفس درجة الحرارة في الفقرة (2) . يرشح المحلول بورق ترشيح للتخلص من بلورات الاوكزاليت غير الذائبة . (2) محلول الايودين : يوزن( 0.33gm) من الايودين و (0.66gm ) من يوديد البوتاسيوم ثم تذوب في (100ml ) من الماء المقطر. (3) الايثانول : يحضر بخلط (75ml ) ايثانول و( 25ml) ماء مقطر ليصبح الحجم ( 100ml ). (4) صبغة السفرانين : يذاب 0.25gm من مسحوق سفرانين بالايثانول بـ (10ml ) ايثانول ثم يكمل الحجم الى( 100ml ) باضافة (90ml ) ماء مقطر. لعمل سلايد الفحص المجهري تكون طريقة العمل كما يأتي: تضاف صبغة الكريستال البنفسجي Crystal violet الى الغشاء البكتيري بعد تثبيته على الشريحة. بعد دقيقة واحدة تغسل الصبغة بالماء و تضاف كمية من اليود Iodine (وهي مادة مثبتة للصبغة). بعد دقيقة واحدة تقريبا , يسكب اليود من على الشريحة. وعند هذه المرحلة يلاحظ ان كلتا المجموعتين البكتيرية السالبة والموجبة لصبغة كرام تبدوان باللون البنفسجي الداكن. تغسل الشريحة بالكحول الاثيلي او محلول Ethanol-acetone وهو مزيل للصبغة, ويلاحظ ان الغسيل بهذه المادة يؤدي الى ازالة الصبغة من بعض الخلايا البكتيرية الموجودة على الشريحة دون بعضها الاخر. يغسل الكحول من الشريحة , و تصبغ بصبغة السفرانين (صبغة حمراء) لمدة دقيقة , وتغسل بالماء وتجفــف و تفحص بالعدسة الزيتية. ميكانيكة عمل صبغة كرام: اختلفت التفسيرات والاراء حول سبب اختلاف استجابة خلايا البكتريا لصبغة كرام مع انها اجمعت على ان سبب الاختلاف عائد اساسا الى اختلاف التركيب الكيميائي لجدار الخلية البكتيرية ومن هذه التفسيرات : جدار البكتريا السالبة يحتوي على نسبة اعلى من اللبيدات Lipids والمواد الدهنية مقارنة بالبكتريا الموجبة كما ان جدار البكتريا السالبة يكون اقل سمكا من الموجبة. جدار البكتريا الموجبة تحتوي على طبقات سميكة من مادة Peptidoglycan مقارنة بالبكتريا السالبة. جدار البكتريا الموجبة يحتوي على مادة معقدة من المغنيسيوم و الحامض النووي RNA بكميات كبيرة.

النتــــــائج عند تقييم الصبغة في مختبر الصحة المركزي ومقارنتها مع صبغة قياسية من انتاج معهد المصول واللقاح وعلى نماذج مختلفة من العتر الجرثومية ، كانت النتائج متطابقة .

المناقشة والتوصيات ان مطابقة نتائج العدة المنتجة في المركز مع عدة قياسية عند تقييم الصبغة تشير الى تنفيذ النتائج المطلوبة من هذا البحث وبشكل مطابق للمواصفات البحثية في المصادر العلمية المعتمدة . واعتمادا على هذه النتائج نوصي بنقل البحث الى مرحلة الانتاج نظرا لكثرة الطلب التجاري على هذا النوع من الصبغات في كافة المختبرات البايولوجية سواء الحكومية او الاهلية كذلك لما له من مردود اقتصادي على المركز .

References: 1. Austrain, R.(1960). “The Gram stain and the etiology of lobar pneumonia, an historical note “.Bacteriol, Rev.24(3):261-265 2. Gram, HC (1884). Milestobes in Microbiology 1546-1940. Translation is also at: Brock, T.D. Pioneers in Medical Laboratory Science: Christian Gram 1884. Retrieved 2010-07-27. 3. Ryan K.J,Ray C.G(editors)(2004). Sherr is Medical Microbiology (4th ed.). Mc Graw Hill. P.P. 232-233. 4. Microbiology; J.G Black, Prentice Hall , 1993.