تحضير عدة قياس قدرة ارتباط الحديد الكلية بالدم

Abstract

الخلاصة نظراً لأهمية الحديد في الجسم فقد هدف البحث إلى تحضير عدة لقياس سعة ارتباط الحديد الكلية بالدم (TIBC:total iron binding capacity) والتي تقيس اكبر كمية من الحديد الذي يمكن أن يرتبط على الترانسفرين (البروتين الناقل للحديد). إذ حضرت العدة من كاشفين باستخدام الطريقة اللونية والتي تضمنت عملية تشبيع الترانسفرين بالحديد وادمصاص الحديد الزائد باستخدام كربونات المغنيسيوم القاعدية ومن ثم قياسه بمكونات عدة قياس الحديد في المصل المحضرة من أربعة محاليل ، والمعتمدة على مبدأ التفاعل الذي يحرر حديد المصل من الترانسفرين بعملية الاختزال في الوسط الحامضي وبإضافة صبغة ferene التي تتفاعل مع ايونات الحديدوز لتكون المعقد اللوني الأزرق الذي يمتص على الطول ألموجي (595) nm . وشدة اللون المتكون تتناسب طرديا" مع كمية الحديد الموجودة في العينة .وكانت نتائج فحص النماذج المرضية بالعدة المحضرة متطابقة مع نتائج العدة الأجنبية ( (Randox عند مقارنتها بها , مما يدل على كفاءة الطريقة المستخدمة و عدم وجود تداخلات في طريقة القياس.

Keywords : Total iron –binding capacity , Anemia, Transferrin, Iron overload

المقدمة يحمل الحديد في الدم على نوع معين من الكلوبيولين يسمى الترانسفيرين واختبار(TIBC) يقيس مقدار كمية الحديد التي يمكن أن تتحد مع بروتينات البلازما. ويساعد الاختبار في تشخيص نقص الحديد والتفريق بين أنواع معينة من فقر الدم والتي تتطلب معالجات مختلفة . يزداد (TIBC) في حالات فقر الدم ونقص الحديد , الحمل , التهاب الكبد , استعمال موانع الحمل عن طريق الفم , الأطفال الرضع , وينخفض في حالات الجوع وسوء التغذية , سرطان الغدة الدرقية والأمراض المزمنة وأمراض الكلى ومرض الثلاسيما (1) .في عام 2000 أكتشف الهبسدين hepcidin وهو هرمون بيبتيدي ينتجه الكبد ويعد المنظم الرئيس لتوازن الحديد في الإنسان والثديات (2).يهدف البحث إلى تحضير عدة لقياس قدرة ارتباط الحديد الكلية بالدم , ومقارنة نتائج العدة المحضرة مع نتائج العدة الأجنبية(Randox ) باستخدام عينات مرضية وملاحظة كفاءتها بالفحص.

الجزء العملي اعتمدت طريقة( Ramsay ) اللونية في قياس( TIBC ) (3) . تتكون العدة من كاشفين : الكاشف الأول (R1) وهو (iron solution) بتركيز ( µmol/L ( 89.5من كلوريد ألحديديك الكاشف الثاني R2) ) وهو كربونات المغنيسيوم القاعدية فضلا عن تحضير مكونات عدة قياس حديد المصل من المحاليل الأربعة الآتية : 1 - محلول الصبغة (Chromogen) (A) بتركيزmmol/L) ( 22.2 من صبغة ferene 2 - المادة المختزلة وهي Ascorbic acid) ) (B ) بتركيز (1.3 mol/L) 3 - المحلول الداريء(Acetate Buffer) (C) بتركيز (0.087 mol/L) و(pH = 4.65) - 4المحلول القياسي(Standard) ( D ) للحديد بتركيز (35.8 µmol/L) طريقة القياس - 1يوضع (0.5 ml ) مصل و(1ml ) من R1) )(iron solution) في أنبوبة الطرد المركزي . - 2تخلط جيداً وتترك لمدة ( 30 – 5 ) دقيقة عند ( 25 – 20 ) درجة مئوية. - 3يضاف ((180 mg من R2( كربونات المغنيسيوم) إلى محتويات الأنبوبة الأولى وتترك لمدة ( 60 – 30 ) دقيقة عند ( 25 – 20 ) درجة مئوية مع الخلط أثناء تلك المدة . - 4تجرى عملية الطرد المركزي لمدة (10) دقائق على سرعة ( 3000 rpm) . - 5يؤخذ الرائق ويقاس بمكونات عدة قياس حديد المصل بإتباع الخطوات الآتية : أ - تؤخذ ثلاثة أنابيب اختبار واحدة لمحلول الكفئ (blank ) وأخرى للمحلول القياسي (Standard ) وثالثة للنموذج (Sample) . ب - يضاف ( µl 1000 ) من محلول البفر (C) و ( 50 µl ) من محلول(B) لكل من الأنابيب الثلاثة أعلاه. ج- يضاف (250 µl) ماء مقطر لأنبوبة الكفئ و(250 µl) من المحلول القياسي (D) لأنبوبة المحلول القياسي و (250 µl) من المصل(الرائق المستخلص ) لأنبوبة النموذج. د- تمزج المواد المضافة جيدا وتسجل قراءة الامتصاصية الأولية ضد محلول الكفئ عند الطول ألموجي 595 نانوميتر . و- يضاف (50 µl) من محلول chromogen (A) لكل من الأنابيب الثلاثة , تمزج جيدا وتوضع عند(20-25)°م لمدة (15) دقيقة ثم تسجل قراءة الامتصاصية النهائية كما موضح بالجدول رقم (1).

جدول رقم (1) يبين طريقة إضافة المحاليل No Blank Standard Sample 1 C) buffer) 1000 µl 1000 µl 1000 µl 2 (B) reductant 50 µl 50 µl 50 µl 3 D.W 250 µl - - 4 (D) standard - 250 µl - 5 Sample - - 250 µl Initial Absorbance 6 (A) chromogen 50 µl 50 µl 50 µl

الحسابات -1 قياس حديد المصل

ΔA= final Absorbance – Initial Absorbance ΔA sample Conc.of iron = x conc. Of standard ΔA standard إذ إن ΔA sample= الفرق بامتصاصية النموذج ΔA standard = الفرق بامتصاصية المحلول القياسي conc. of standard = تركيز المحلول القياسي المستخدم (g/dlµ 200 )

2 – قياس قدرة ارتباط الحديد الكلية

TIBC (mg/dL) = A sample x 0.6 A standard TIBC (µ mol/L) = A sample x107.4 Astandard النتائج والمناقشة حضرت عدة لقياس TIBC بالدم بالطريقة اللونية , باستخدم حامض الهيدروكلوريك لتحرير الحديد من الترانسفرين في عينة مصل الدم بدلا من المحلول المائي لحامض الاسكوربيك إذ يحافظ على طريقة فحص العدة TIBC بشكل دقيق حتى بعد التخزين وهذه النتائج تتفق مع ما ورد في طريقة ( 1973 , Burke ). (4) كما استخدمت كربونات المغنسيوم مادة مدمصة كونها أفضل من الطرق الأخرى التي استخدمت تقنية الالومينا والتي تعطي نتائج سالبة. تغير الدرجة الحامضية يسبب تحرر كل ذرات الحديد من الترانسفيرين تلك التي ارتبطت بواسطة صبغة الحديد المرتبطة مع الحديد الزائد منتجة معقد لوني . قورنت نتائج العينات المرضية باستخدام العدة المحضرة والعدة الأجنبية ( Randox ) وكانت النتائج كما موضح في الجدول رقم (2). جدول رقم (2) يوضح قيم TIBC (µ mol/L)المقاسة بالعدة المحضرة في المركز وبالمقارنة مع العدة الأجنبية التسلسل العدة المحضرة العدة الأجنبية Randox 1 61 58 2 90 88 3 80.5 80 4 51.5 50 5 48 48 6 52 51 7 58.8 60 8 67 68 9 51 51 10 68 70 11 61 58 12 59 61 13 60 57 14 68 70 15 64 64.4 16 75 73.6 17 58.8 60 18 58.2 59 19 67.4 68 20 69.2 69.5

يلاحظ من النتائج أنفاً عدم وجود فروقات كبيرة أو محسوسة بين القيم المقاسة بالعدتين مما يدل على كفاءة الطريقة المستخدمة. ولدقة الفحص يجب تجنب استخدام عينات الدم المتحللة أو التي تحوي موانع التخثر إذ من الممكن أن تعطي نتائج خاطئة نتيجة لتداخلها مع التفاعل وبالتالي تأثيرها على شدة لون المعقد المتكون من الصبغة وهذه تتفق مع ما ذكره Tietz)) ( (5.أوضحت الدراسات الحديثة إن الانترلوكين IL-6 ) ) ينظم تعبير الهبسيدين , إذ ان الكبد يستجيب للسايتوكينات بإنتاج كميات كبيرة من الهبسيدين , الذي يوقف عمل بروتينات الحديد ويمنعها من إطلاق مخزون الحديد 6) ) . وقد قيمت العدة المحضرة من قبل مختبرات الصحة العامة المركزي / وزارة الصحة وكانت جيدة. المصادر 1-Joshi S.V. ,Gupta M.K. , Dhar H.L.,(2011) anaemia in elderly correlation with diet &diseases. Bombay Hospital J., vol.53,No.2. 2-Atanasiu V, Manolescu B, Stoian I (January 2007). "Hepcidin--central regulator of iron metabolism". Eur. J. Haematol. 78 (1): 1–10. 3- Ramsay WN.( 1957).The determination of the iron-binding capacity of serum. Clin Chim Acta. 1957;2:221–6. 4- Burke (1973). The Burke method (U.S.Pat.No . 3709985). 5- Burtis, Carl A. ,Ashwood, Tietz Textbook of clinical chemistry & molec. .diagnostics vol 3, (2005) p.1186

6-Jodie L. Babitt, Franklin W. Huang, Yin Xia, Yisrael Sidis, Nancy C. Andrews, and Herbert Y. Lin (2007). Modulation of bone morphogenetic protein signaling in vivo regulates systemic iron balance. Amer.Soci.for Clin. Invest. ,J .Clin. Invest. July 2; 117(7): 1933-1939