16تحضير عدة الكشف عن نقص انزيم G6PDH

Abstract

الخلاصة يعد مرض أنيميا الفول (Fasium ( من أكثر أمراض الأنزيمات إنتشارا في العالم إذ يصيب حوالي (400 مليون) شخص حول العالم وهو مرض وراثي متنحي مرتبط بالجنس (بكروموسوم x ) . يتميز المرض بضعف أو عدم قدرة الخلايا الحمراء على إنتاج إنزيم سداسي فوسفات الكلوكوز النازع للهيدروجين ( G6PD ) الذي يلعب دورا هاما في عملية أيض الخلايا الحمراء . ونظراً لأهمية هذا الانزيم فقد حضرت عدة للكشف عن نقص انزيم ( G6PD) بطريقة Beutler)) وتكونت العدة من كاشفين الأول :هو المادة الاساس ( Substrate ) وباستخدام مادة الكلوتاثيون والثاني هو البفر : ومبدأ التفاعل يعتمد على إنتاج النيكوتين أمايد أدينين داي نيوكليوتايد هايدروجين فوسفيت ( NADPH ) الذي يتوهج تحت الاشعه فوق البنفسجية عند وجود الأنزيم , فقد فحصت عينات دم المرضى قيد الدراسة بالعدة المحضرة وقورنت نتائجها بنتائج العدة المستوردة ( Atlas Medical ) وكانت النتائج متطابقة , ويعد هذا الاختبار من الاختبارات النوعية السريعة للكشف عن نقص الانزيم وقد قيمت العدة في مختبر الصحة العامة المركزي

Glucos - 6 – P + NADp+ G6-PDH gluconate 6-p + NADPH +H+

Keyword : G6PD, anaemia .

المقدمة يلعب أنزيم سداسي فوسفات الكلوكوز دي هايدروجينيز( G6PD ) دورا أساسيا في عمليات الأيض في الخلايا الحمراء وهو مسؤول بشكل مباشر عن انتاج ( NADPH ), أذ يلعب (NADPH ) دورا هاما في خلايا الدم الحمراء عبر امداد الخلية بمادة الكلوتاثيون المختزل [1]. يؤدي نقص أنزيم ( G6PD ) الى نقص انتاج الكلوتاثيون المختزل مما يجعل الخلايا الحمراء معرضة للتحلل والتكسر قبل موعدها [2]. يحدث الانحلال ( تكسر الدم ) عند تعرض الجسم لأي مادة مؤكسدة مثل تناول البقوليات ومنها الفول لذا يطلق على نقص هذا الانزيم ( فقر دم الفول ) , تناول بعض أنواع الادوية , بعض أنواع المضادات الحياتية وبعض مسكنات الالم , والتعرض لللالتهابات الفيروسية أو البكتيرية , ومرض الحامض الكيتوني السكري .كما يعد مرض أينميا الفول من الامراض الوراثية المرتبطة بالجنس إذ يحدث نتيجة لطفرة موجودة على الذراع الطويل لكروموسوم x , لذلك تؤثر على الذكور أكثر من الاناث وينتقل من الأم التي تكون حاملة للمرض [3]. ونظرا لخطورة هذا المرض فقد هدف البحث الى تحضير عدة كشف سريع عن هذا المرض باستخدام اختبار( Beutler fluorescent spot) .

الجزء العملي -1طريقة العمل : 1-1- جمعت عينات من الدم بصورة عشوائية من الاطفال والبالغين , أما أن توضع قطرة منه مباشرة على ورق ترشيح خاص وتجفف أوان تحفظ بأنابيب حاوية على مادة الهيبارين . 2-1ـ اعتمدت طريقة (Beutler) في الكشف عن الاصابة بنقص انزيم ( G6PD )[4] , إذ حضرت العدة من كاشفين 1-2-1- الكاشف الاول ((Substrate حضر من : Glucose - 6 Phosphate) - ( بتركيز 1)mmol/L ) وذلك بوزن (0.028/100) g/ ml NADP) - ) بتركيز /L 0.75) mmol ) وذلك بوزن g/ ml 0.059 / 100) ) -كلوتاثيون ((GSSG بتركيز 0.8) mmol/ L) بوزن 0.049 /100) g/ ml ) - 2-2-1 الكاشف الثاني ( Buffer ) حضر من : - بفر Tris-HCl ( 7.2 ) بوزن 12.1) g/L ) ودرجة الحامضية ( 7.2 ) وضبط بـ 0.1)M) HCl - يحضر ال (Saponin) بتركيز ( %( 0.2 . 2- طريقة القياس : 1-2- وضعت قطرة من عينات الدم التي جمعت على وسط ورقة ترشيح دائرية قطرها 5-3 ) mm) وجففت الورقة . 2-2- حضر محلول الكشف ( Reagent Solution ) وذلك بخلط مكونات الكاشف الاول ( Substrate ) مع مكونات الكاشف الثاني البفر) Buffer) . 3-2- وضعت ورقة الترشيح مع قطرة الدم المجففة في 0.1) ml) من محلول الكشف المحضر(Reagent Solution) خلطت جيداً ووضعت عند حرارة 25) Co ) لمدة min(10). 4-2- وضع 0.01)ml) من محلول الفحص ( Test Solution ) على ورقة ترشيح جديدة لحين جفافها بعد (1) h. بعد جفاف ورقة الترشيح مع محلول الفحص ( Test Solution ) عرض لضوء الاشعة فوق البنفسجية وقرأت النتائج .

النتائج والمناقشة حضرت عدة للكشف عن نقص انزيم (G6PDH) لعينات دم المرضى قيد الدراسة بطريقة Beutler fluorescent spot)) . لوحظ ان العينات الطبيعية اظهرت توهجا قويا مما دل على حدوث التفاعل بسبب وجود الانزيم الذي حرر ( NADPH ) الذي يتوهج تحت الاشعة فوق البنفسجية , وعدم ظهور التوهج في العينات الاخرى بعد min(10) من فترة الحضانة دل على النتيجة الموجبة للفحص , اي وجود نقص في انزيم ( G6PDH ) أو عدم وجوده لعدم حدوث التفاعل , إذ عند نقص هذا الانزيم بسبب بعض العوامل يصبح الكلوتاثيون غير قادر على أداء وظيفته فيؤدي الى تجمع ( H2O2 ) داخل الخلية وتكوين الميتا هيموكلوبين وتكسر خلايا الدم , ومن هنا تظهر أهمية هذا الفحص خصوصا في الاطفال المصابين بفقر الدم الحاد والشديد [5]. كما ان المرض يكون اكثر شدة في الاشخاص متماثلي الزيجات (Homozygotes) فضلا عن إختلاف الطفرات الجينية التي تسبب إختلاف في درجة مستوى نقص الانزيم ( إذ هناك 160 طفرة مختلفة ) [6] . كما استخدمت عينات قياسية وقورنت نتائج العدة المحضرة مع نتائج العدة المستوردة وأظهرت نتائج مطابقة ودل هذا على كفاءة الطريقة المستخدمة فضلا عن سرعتها في الكشف و لا تتطلب مستلزمات كثيرة وسهلة التعامل بها ومنخفضة الكلفة مقارنة بالطرق الأخرى .

المصادر 1- Frank,J.E. (2005) . Diagnosis and management of (G6PD) deficiency . Am. Fam. Physician 72 (7) : 1277 – 82 .PMID ( 6225031 ) 2- Gaskin R.S.,E. stwick D , Peddi R (2001 ) . (G6PD) deficiency its role in the high Prevalence of hypertension and diabetes mellitus. Ethnicity . Disease 11 (4): (749-54) . PMID ( 11763298 ) . 3- Shekalaghe,S.A. etal.(2010).In Tanzania , Hemolysis after single dose of primaquine co administered with an artemisinin is not restricted to ( G2PD ) A- individuals . Antimicrobial Agents Chem. other 54 , 1762-1768 . 4- Beutler,E. Drug induced haemolytic anemia & non Spherocytic haemolytic anaemia . In ( G6PD ) deficiency ( Yoshida A & Beutler E , Eds ) PP3 – 12 ,Academic ,orlanda . 5- Beutler,E. (2008) G6PD deficiency : a historical perspective . Blood 111 (1) : (16-24) 6- Beutler,E.(2011).G6PD deficiency and other red cell enzyme abnormalities.Chapter(45).Hematology.PMID:( 9424740 ).