21تحضير عدة قياس الكلوتاثيون في مصل الدم البشري

Abstract

الخلاصة يعتبر الكلوتاثيون من أهم مضادات الأكسدة في النباتات والحيوانات والفطريات وبعض البكتريا . وهي المركبات التي تمنع الضرر الذي يصيب الخلايا بسبب مركبات الأوكسجين الفعالة (reactive oxygen species) مثل الجذور الحرة وإنزيمات البيروكسديز (free radicals &peroxidase ) . حضرت عدة لقياس مستوى الكلوتاثيون في مصل الدم بإتباع طريقة (Ellmanʼs method ) , أجري الفحص لـ ( 12) عينة من مصل أشخاص يشتبه بإصابتهم بداء السكري , ومقارنة النتائج مع عدة أجنبية , حيث يتضح أن أمتصاصية الكلوتاثيون كانت متقاربة للنماذج باستخدام العدتين للمقارنة . وكان المعيار القياسي ( SD) =0.272599 . وعدم تسجيل فروقات معنوية بين كلا العدتين .

الكلمة المفتاحية : Glutathion , Antioxidants , oxidative stress .

المقدمة الكلوتاثيونGlutathione) ) هو ببتيد ثلاثي يتكون من ثلاثة أحماض أمينية هي : حامض الكلوتاميك وحامض السيستين والكلايسينL- glutamine) , (cysteine) , (glycine) ) . ويرمز للكلوتاثيون بالرمز(GSH) عندما يكون مختزلاً، وبالرمز (GSSG) عندما يكون مؤكسداً. ويعمل مرافق إنزيمي (Coenzyme) ، ومضاد أكسدة ( (Antioxidantلحماية الخلايا من ضرر الجذور الحرة ( Free radical ) , ويعد الكلوتاثيون هاماً لسلامة خلايا الدم الحمراء وعمل البروتينات والأغشية الدهنية وغيرها ]1,2 [ . يعتبر الكلوتاثيون من أهم مضادات الأكسدة في النباتات والحيوانات والفطريات وبعض البكتريا . وهي المركبات التي تمنع الضرر الذي يصيب الخلايا بسبب مركبات الاوكسجين الفعالة (reactive oxygen species) مثل الجذور الحرة وإنزيمات البيروكسديز (free radicals &peroxidase ) ]1,2 [. إن مجموعة الثايول (thiol group) في جزيئة الكلوتاثيون تعتبر عوامل مختزلة في الخلايا الحيوانية , إذ يختزل الكلوتاثيون الأواصر ثنائية السلفايد disulfide bonds التي تتكون في سايتوبلازم الخلية وذلك بالعمل كواهب للالكترونات . وبهذه العملية يتحول الكلوتاثيون الى شكله المتأكسد (glutathione disulphide GSSG) . وعندما يتأكسد الكلوتاثيون يمكن أن يختزل مرة أخرى بأنزيمات مختزلة , وبوجود NADPH كواهب للألكترونات ]1,2,3[ . وتستخدم النسبة بين تركيز الكلوتاثيون المختزل الى المؤكسد داخل الخلية الحية مقياسا" للتسمم الخلوي cellular toxicity . ففي الأنسجة السليمة تكون نسبة (90 %) من الكلوتاثيون مختزلاً GSH) ) وأقل من (10%) يكون بالشكل المؤكسد (GSSG) وبذلك فإن الارتفاع في نسبة GSSG – GSH) ) تعتبر مؤشر هام لحالة شد الأكسدة (oxidative stress) ]3[ .

وظائف الكلوتاثيون ] 3[ : -1 يعتبر الكلوتاثيون من أهم مضادات الأكسدة داخل الجسم الحي والذي تنتجه الخلايا , ويلعب دوراً هاماً في معادلة الجذور الحرة مع مركبات الأوكسجين الفعالة (reactive oxygen compounds) إضافة الى الحفاظ على مضادات الأكسدة من خارج الجسم مثال فيتامين C) ) وفيتامين (E) والعمل على إبقائهما بالشكل المختزل الفعال . 2- يدخل الكلوتاثيون في التفاعلات الأيضية والبايوكيماوية , مثال ذلك عملية تصنيع وترميم DNA)) وتصنيع هرمون Prostaglandins)) ونقل الأحماض الامينية , وتفعيل الأنزيمات . وبذلك فإن كل أنظمة الجسم تتأثر بحالة الكلوتاثيون وبخاصة الجهاز المناعي , العصبي , الهضمي والرئتين . 3- يلعب الكلوتاثيون دوراً حيوياً في عملية تأيض الحديد . تنخفض مستويات الكلوتاثيون في حالات اختلال توازن النتروجين كما يحدث عند الإصابة بأمراض السرطان , HIV)) , الحروق , الصدمات وحالات فرط التدريب لدى الرياضيين .

مضادات الاكسدة هي جزيئات تقوم بتثبيط عملية أكسدة جزيئات أخرى . أماعملية الأكسدة ( (oxidation فهي تفاعل كيماوي تنقل من خلاله الإلكترونات أو جزيئات الهيدروجين من المركبات المختلفة الى العوامل المؤكسدة (oxidizing agents) . هذا النوع من التفاعلات الكيماوية ينتج ما يعرف بالجذورالحرة (free radicals), تطلق هذه الجذور تفاعلاً كيماوياً متسلسلاً والذي بمجرد أن يبدأ داخل الخلية الحية فإنه قد يتسبب بضرر أو موت للخلايا أو الأنسجة التي تشهد حدوث مثل هذا التفاعل .وهنا يأتي دور مضادات الأكسدة حيث تنهي وتوقف هذه التفاعلات المتسلسلة وذلك بإزالة المركبات الوسطية الناتجة أثناء التفاعل والتي تحمل جذوراً حرة , وبذلك تثبط تفاعلات الأكسدة الأخرى , وهذا يتم بأن تتأكسد مضادات الأكسدة نفسها , أي تعمل كعوامل مختزلة (reducing agents) مثال ذلك مركبات (Thiol) ,( Ascorbic acid) , والمركبات متعددة الفينول ((polyphenols . بالإضافة إلى ذلك فإن تفاعلات الأكسدة ذات أهمية حاسمة في حياة المخلوقات الحية , إذ يمكنها أن تخرب الأنظمة الحيوية في النباتات والحيوانات, ولهذا احتوت هذه المخلوقات على أنظمة معقدة تضم الكثيرمن مضادات الأكسدة مثلvitamin (C) , vitamin (E) glutathione , vitamin (A) , . إضافة إلى بعض الأنزيمات مثال catalase) ) و إنزيم ((superoxide dismutase والعديد من إنزيمات peroxidases)) ]5 [. إن النقص الحاصل في مضادات الأكسدة أو تثبيط إنزيمات مضادات الأكسدة يسبب ما يسمى بجهد التأكسد (Oxidative stress) والذي يسبب ضرراً في الخلايا قد يؤدي الى موتها . إن جهد التأكسد يسبب أضراراً في تركيبة الخلايا ووظائفها بسبب الفعالية العالية للجزيئات الحاوية على الأوكسجين . وقد اتضح من الدراسات أن جهد التأكسد يلعب دوراً ملحوظاً في العديد من الأمراض أهمها الأمراض السرطانية ]5,6 [.

إن مضادات الأكسدة هي مركبات يمكن أن تصنع داخل الجسم أو تستحصل من الغذاء . كما مبين في الجدول رقم (1) :

جدول رقم (1) يبين أنواع مضادات الأكسدة وتراكيزها داخل أنسجة الجسم ]6[ No. Antioxidant metabolite Solubility Concentration in human serum (μM) Concentration in liver tissue (μmol/kg) 1 Ascorbic acid (vitamin C) Water 50 - 60 260 (human) 2 Glutathione Water 4 6,400 (human) 3 Lipoic acid Water 0.1 - 0.7 4 - 5 (rat) 4 Uric acid Water 200 - 400 1,600 (human) 5 Carotenes Lipid β-carotene: 0.5 - 1 retinol (vitamin A): 1 - 3 5 (human, total carotenoids) 6 α-Tocopherol (vitamin E) Lipid 10 - 40 50 (human) 7 Ubiquinol (coenzyme Q) Lipid 5 200 (human)

المواد المستخدمة وطرق العمل : أعتمدت طريقة (Ellman ʼs method) لقياس تركيز مركبات الثايول في مصل الدم ]2,4 [. المواد المستخدمة : 1- H2NaPO4 ( M0.2 ( . -2 Na2HPO4 ( M0.2 ( . 3- [DTNB reagent] [5,5- Dithiobis ( 2- nitrobenzoic acid)]

- طريقة تحضير المحاليل : 1- حضر محلول (A) phosphate buffer بالأس الهيدروجيني = 7 2- حضر محلول ( B ) phosphate buffer بالأس الهيدروجيني = 8 3- حضر محلول ( C ) بإذابة (mg 39.6) من مادة (DTNB) في ( ml10) من المحلول A)) .

طريقة العمل اجري الفحص بأخذ (12) عينة من أشخاص مصابين بداء السكري والذي عادة يكون مصاحباً" لارتفاع تركيز الكلوتاثيون . 1- أخذ ( 0.02 ml ) من مصل الدم وأضيف إليه ( 9 ml) من الماء المقطر . 2- أضيف (1 ml) من المحلول B)) إلى العينة انفا" ومزجت جيداً . 3- سحبت (3 ml) من المحلول في الخطوة (2) واضيف ( 0.02 ml ) من المحلول C)) , مزج جيداً وترك لمدة (60 min) في درجة حرارة الغرفة (25 Cº). 4- حضر محلول التصفير (Blank) كما ورد بالخطوتين ( 1 ، 2 ) . 5- قرأت الامتصاصية بطول موجي λ = 420 nm. النتائج والمناقشة أخذت (12) عينة لأشخاص مصابين بداء السكري والذي يعتبر من الحالات المصاحبة لارتفاع مستوى الكلوتاثيون في الدم . وعند قياس تركيز الكلوتاثيون باستخدام العدة البحثية ومقارنة النتائج مع عدة أجنبية بطريقة الاليزا , اتضح مطابقة النتائج كما موضح في الشكل رقم (1) والجدول رقم (2) اذ أمكن الحصول على مقارنة واضحة للقراءات لكلتا العدتين . جدول رقم ( 2 ) مقارنة الامتصاصية بين العدة البحثية وعدة أجنبية No. Groups Eliza kit (A°) Al-razi kit (A°)

1 Patient 1 1.594 1.647 2 Patient2 1.9 1.852 3 Patient3 2.473 2.669 4 Patient4 1.35 1.218 5 Patient5 1.561 1.479 6 Patient6 1.649 1.376 7 Patient7 2.041 2.122 8 Patient8 1.569 1.445 9 Patient9 1.451 1.744 10 Patient10 1.574 1.345 11 Patient11 1.594 1.694 12 control 1.395 1.317

شكل رقم (1) يوضح مقارنة بين امتصاصية A°) ( لـ (12) نموذج بين العدة البحثية وعدة اجنبية بطريقة الاليزا .

المصادر -1Arias, I.M. and Jakoby W.B. (1976) , "Glutathione: Metabolism and function", editors. Raven Press, New York -2Eyer, P. and Podhradsky, D. (1986). Evaluation of the micromethod for determination of glutathione using enzymatic cycling and Ellman’s reagent. Anal. Biochem.153; 57-66. -3Baker, M.A., Cerniglia, G.J. and Zaman, A. (1990). Microtiter plate assay for the measurement of glutathione and glutathione disulfide in large numbers of biological samples. Anal. Biochem.190; 360-365. -4Ellman,G.L. 1959,Tissue sulfhydryl groups. Arch.Biochem.Biophys., 82; 70-7. -5Galli,F. (2005). Oxidative stress and reactive oxygen species ,Contrib.Nephrol, 149;240-60. -6Halliwell,B., Gutteridge,J.M.G.and Cross,C.E. (1992), Free radicals, antioxidents and human diseases . Clin. Lab. Med., 119;.598-620.