استخلاص وتوصيف وتقييم فعالية مستخلص بذور العنب الأحمر كمادة مضادة للأكسدة.

Abstract

الخلاصة يهدف البحث إلى إستخلاص مسحوق بذور العنب الاحمر (Vitisvinifera L.) باستخدام التقنيات التقليدية للحصول على مستخلصات لثلاثة نماذج (1 , 2 , 3) على التوالي ودراسة فعاليتها كمضادات للأكسدة ومقارنتها مع فيتامين C ومضادات الاكسدة المخلقة (BHT). كُشف كيميائيا عن بعض المكونات الكيميائية (المجاميع الفعالة) للمستخلصات المحضرة انفا ً وتبين إحتوائها على نسب متفاوته من المجاميع الكيميائية الفعالة كالعفصيات، كاربوهيدرات، كلايكوسيدات، راتنجات، فينولات، فلافونيدات، قلويدات وتربينات. أجري اختبار السمية للمستخلصات وبعدة تراكيز على مجموعة من حيوانات المختبر (Swiss albino mice) ولوحظ خلوها من السمية، كذلك أجري الكشف عن تركيز محتوى الفينولات لها بإستعمال طريقة (Folin-Ciocalteu) وكان هناك تفاوتاً ملحوظاً بين النماذج بسبب طريقة الاستخلاص و المذيب المستخدم . توصلت فحوصات المقارنة بين فعالية المستخلصات للنماذج (1) ، (2) ، (3) كمضادات للأكسدة ، ان كفاءة الفعالية المضادة للاكسدة تتناسب عكسيا مع قيمة (Ec50)، كما ان (Ec50) للمستخلص الأقل من (10ملغم / مل) تدل على أن المادة كفؤة كمضادة للاكسدة ، حيث كانت قيمة (Ec50) لنموذج رقم (3) اقل من (10ملغم / مل)، كذلك بالنسبة للنماذج (1) و(2) لكن بكميات متفاوتة مقارنة مع مضادات الاكسدة (BHT) وفيتامين ((C.

الكلمات المفتاحية :- العنب الاحمر , إستخلاص , مضادات أكسدة , السمية , بذور العنب الأحمر.

المقدمــــة أثبتت العديد من الدراسات أن الغذاء النباتي, يحمي الأنسان من الإصابة بأمراض السرطان وأمراض القلب التي تسبب نسبة وفيات عالية[1]، ذلك كون المواد الكيميائية النباتية تؤدي دوراً وقائياً ضد العديد من الأمراض المزمنة للأنسان[2], وتساهم بدور كبير في الفعاليات المضادة للأحياء المجهرية و المضادة للأكسدة كما أظهرت بعض الدراسات إن للنباتات الطبية فعلاَ فسلجياً و دوائياً واسعا في معالجة الامراض وهـــي آمــنة الاستعمال والآثـار الجانبـية التـي تحدثها اقـــل ضررا مقــارنة مـع العقـاقيـــر المخلقــــة صناعيـــاً[3]. يعد العنب من أقدم الفواكه في التأريخ, وهو نبات متسلق معمر يختلف مظهره باختلاف طريقة زراعته, كما يختلف حجمه حسب طبيعة الصنف والعمر وغيرها من العوامل, يتكون عنقود العنب من الهيكل والثمرة والبذرة التي تكون بشكل كمثري ولها منقار طويل بداخلها جنين , تغطيها قشرة صلبة , يصل طولها إلى ( 25.0- 7.0) سم , تكون البذرة خضراء ثم تتحول إلى اللون البني الداكــن عــند النضج , يحوي العنب الاحمر (Vitisvinifera L.) على الحوامض العضوية مثل حامض الماليك (Malic acid) , التارتاريك (Tartaricacid) , الستريك (Citric acid) وبعض الأحماض الامينية مثل البرولين ((Proline[4] , كذلك يحتوي على العديد من المركبات الفعالة من بينها المركبات الفينولية وغير الفينولية التي لها انتشار واسع في المملكة النباتية كنواتج أيض ثانوي فضلا عن كون هذه المركبات مصدرا غذائيا ذو تأثيرات فسيولوجية عديدة مثل كونها مضادة للأكسدة Antioxidant)) وللالتهابات (Antiflamintary)[5]. نظراً للإهتمام الكبير حول إستعمال بذور العنب لإحتوائه على أسرار علاجية عديدة , جاءت الدراسة لتهدف إلى تحضير مستخلصات البذور للعنب الأحمر (Vitisvinifera L.) بطرق مختلفة لدراسة فعلها كمضادات أكسدة من خلال قياس فعاليتها لإقتناص الجذر الحر الثابت (DPPH)(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) والمقارنة فيما بينها و مضادات الأكسدة الصناعية (BHT)(Butylatedhydroxytoluene) وفيتامين ((C. الجزء العملي 1- تصنيف النبات:- أرسلت نماذج من النبات الى معشب كلية العلوم – قسم علوم الحياة / جامعة بغداد وتبين أنها Vitisvinifera L.)). 2- تنقية مسحوق بذور العنب الاحمر من المواد الدهنية والزيوت:- أشتريت بذور العنب من الاسواق المحلية (عراقي المنشأ) وطحن بواسطة الطاحونة الكهربائية للحصول على مسحوق ناعم منه، وضعت (125 غم) من مسحوق بذور العنب في كشتبان مع (700 مل) من الهكسان في منظومة (Soxhlet) لمدة (5 ساعات) عند درجة حرارة (60 ˚م). حصل على (100 غم) من مسحوق بذور العنب منزوع الدهون و(11 مل) من الزيت الثابت، حفظ في قنينة محكمة الغلق. و فيما يلي طرق تحضير النماذج الثلاثة (1 ، 2 ، 3 ) اولا:- استخلاص بذور العنب بإستخدام منظومة (Soxhlet) نموذج رقم (1):- وضع (100 غم) من مسحوق بذور العنب المنقى من الدهون في كشتبان مع (700 مل) من الميثانول في منظومة (Soxhlet) لمدة (10 ساعات) عند درجة حرارة (60 - 70)˚م، ركز المستخلص بإستخدام المبخر الدوار تحت الضغط المخلخل، أضيف إلى المتسخلص المركز حجم مضاعف على دفعتين من الهكسان، رشح وجفف ، حفظ المستخلص (5,3) غم في حاوية زجاجية معتمة ومحكمة الغلق لحين الاستخدام . ثانيا :- استخلاص بذور العنب بطريقة النقع بإستخدام الحاضنة الهزازة نموذج رقم (2):- وضع (100 غم( من مسحوق بذور العنب المنقى من الدهون في دورق مخروطي سعة (1 لتر( مع (700 مل( من الميثانول لمدة (24 ساعة( في الحاضنة الهزازة عند (37 ˚م( ، رشح وركز بإستخدام المبخر الدوار، أضيف إلى المتسخلص المركز حجم مضاعف على دفعتين من الهكسان ورشح، حفظ المستخلص (4 غم( في حاوية زجاجية معتمة ومحكمة الغلق لحين الاستخدام . ثالثاً :- استخلاص بذور العنب بطريقة النقع بإستخدام الحاضنة الهزازة نموذج رقم (3):- وضع (100 غم( من مسحوق بذور العنب المنقى من الدهون في دورق مخروطي سعة (1 لتر( مع حجم من الاثيل اسيتيت : ماء مقطر بنسبة (3:17) لمدة (5 ساعات( في الحاضنة الهزارة عند (37 ˚م( وتكررت العملية مرتان ، رشح المستخلص ثم ركز بإستخدام المبخر الدوار، أضيف إلى المستخلص المركز حجم مضاعف على دفعتين من الهكسان ورشح ، حفظ المستخلص (2,8) غم في حاوية زجاجية معتمة ومحكمة الغلق لحين الاستخدام. 3- تقدير كمية الفينولات الكلية :- قدرت كمية الفينولات في المستخلصات للنماذج (1، 2، 3) بإستعمال طريقة (Folin - Ciocalteu)، بإذابة (1) غم من المستخلصات النباتية في (46 مل( من الماء المقطر، أضيف (1 مل( من كاشف (Folin-Ciocalteu) ، خلط المزيج جيدا ثم أضيف إليه (3 مل( من محلول (2 %) كاربونات الصوديوم ، ترك الخليط لمدة ساعتين مع الرج المتقطع ، قيست الامتصاصية عند طول موجي (765 نانومتر(، حسبت كمية الفينولات في المستخلصات إعتمادا على العلاقة البيانية بين تركيز الحامض والامتصاص بإستعمال محلول قياسي من حامض الكالك (Gallic acid) ، جدول (2) للتراكيز (10 ، 25 ، 50) ملغم/ مل على التوالي لكل نموذج . 4- فحص السمية ((Toxicity test:- أجري اختبار السمية وفق OECD Guidelines for the testing of chemicals (2000) , باستخدام الفئران البيض (Albino) , بواقع (3) مجاميع وكل مجموعة تكونت من (3) فئران وجرعت بالنسب ( 50 ، 300 ، 2000) ملغم / كيلو واحد من وزن الحيوان . أذيبت كل جرعة في (1مل) من الماء المقطر المعقم وحقن بها الفأر داخل غشاء البريتون (Intraperitoneal injection) , سجلت الملاحظات والعلامات والأعراض غير الطبيعية التي يمكن حدوثها خلال (4 ساعات) ومن ثم الى اليوم التالي . 5- تقييم الفعالية المضادة للاكسدة بإستخدام طريقة (DPPH):- حضرت كمية (5 مل) من (DPPH) 2,2-diphenyl-1-picryhydrazyl وبتركيز (0.004 %) في الميثانول ومزجت مع (50 مايكرولتر) لتراكيز مختلفة من المستخلص المراد تقييم فعاليته كمضاد للأكسدة هي كما يأتي (5 ، 10 ، 15 ، 25 ، 35 ، 50) ملغم/مل, مزج كل تركيز مع محلول من (DPPH) المحضر, ترك لمدة (30 دقيقة) . قيست الامتصاصية لكل منها على طول موجي (517 نانومتر) بإستخدام جهاز( (Spectrophotometer واستخدم كحول الميثانول (Blank) في تصفير الجهاز. قورنت النتائج مع كل منButylated Hydroxytoluene) (BHT)( وفيتامين C)) (سيطرة موجبة) كمضاد أكسدة ، حيث الأول مضاد صناعي في حين الثاني مضاد طبيعي ، كررت الاختبارات ثلاث مرات. حسبت النسبة المئوية لإختزال مادة (DPPH) (القابلية على اختزال الجذور الحرة) من المعادلة التالية :- Reduction % = {(Abs (DPPH) - Abs Dil.) /Abs (DPPH)} × 100 حيث أن Abs (DPPH) = معدل الامتصاصية لمحلول (DPPH) Abs Dil. = معدل الامتصاصية للمحلول المخفف لتراكيز المستخلص المراد قياس فعاليته كمضاد للأكسدة مع (DPPH). النتائج والمناقشة الجدول رقم (1) يوضح نتائج الكشف الكيميائي (التقسيم الكيميائي) للمجاميع الفعالة في مستخلصات بذور العنب الاحمر(Vitisvinifera L.) للنماذج (1) ، (2) ، (3). جدول رقم (1) الاختبارات النوعية الكيميائية لمستخلصات بذور العنب الاحمر.

ت

نوع المستخلصات نوع الكشف Tannins Carbohydrate Glycosides Phenols Resins Flavonoid's Saponin Alkaloid Protein Coumarins Terpenes Steroids 1 المستخلص لنموذج (1) ++ + + + ++ + ++ ++ - - + - 2 المستخلص لنموذج (2) ++ + + + + + ++ ++ - - + - 3 المستخلص لنموذج (3) ++ + + - + + + ++ - - + -

تمتاز الفينولات والفلافونيدات بكونها صبغات نباتية تذوب في الماء ومعظم التأثيرات العلاجية للنباتات الطبية يعود لوجودها، اذ تعمل كمضادات للاكسدة، كذلك تمتاز بفعاليتها المضادة للخلايا السرطانية وفعاليته تكمن في ازالة الجذورالحرة OH) , (O2 أما التانينات فهي مركبات فينولية ذات أوزان جزيئية عالية, تعتبر مضادات للأكسدة ولها فائدة طبية في تكوين الأنسجة الجديدة وشفاء الأغشية المخاطية. أجري الكشف عن تركيز محتوى الفينولات للنماذج أنفاً، جدول رقم (2). حيث ان هنالك تفاوت ملحوظ بين النماذج والذي يعود إلى طريقة الاستخلاص والمذيب المستخدم، إذ ان عملية عزل المركبات الفينولية تعتمد على قطبية المذيبات المستخدمة والتي بزيادتها يزداد ارتباطها بمجاميع الهيدروكسيل المرتبطة بالحلقة الاروماتية في المستخلصات النباتية وبالتالي يكون اكثر فعالية كمضادات للأكسدة.

جدول رقم (2) التركيز الكلي لمحتوى الفينولات في مستخلصات بذور العنب الاحمر. ت انواع التراكيز المستخلص لنموذج رقم (1) المستخلص لنموذج رقم (2) المستخلص لنموذج رقم (3) 1 التركيز (ملغم/ مل) 10 25 50 10 25 50 10 25 50 2 التركيز الكلي للفينولات(مايكرو غم / غم ) 875.0 895.1 562.3 770.0 395.1 125.4 833.1 645.4 520.8 اجريت تجارب لفحص فعالية مستخلصات بذور نبات العنب الاحمر المختلفة كمضاد للأكسدة , جدول رقم (3) ومقارنتها مع مضادات الاكسدة الصناعية (BHT) وفيتامين (C). الجدول رقم (3) يبين قيم الامتصاص لمستخلص بذور نبات العنب الاحمر نموذج (1)، (2), (3).

الاشكال رقم (1)، (2)، (3) توضح النسبة المئوية لاختزال مركب (DPPH) باستخدام نماذج مختلفة من بذور العنب مع استخدام عامل سيطرة من مصدر طبيعي (فيتامين C) ومصدر صناعي (BHT). تبين ان قابلية ازالة الجذور الحرة او مايعرف (Ec50) لنموذج بذور العنب الأحمر للمستخلص لنموذج رقم (3)، هو الافضل وألاعلى حتى من السيطرة نفسها ، يليه نموذج رقم (1) ثم (2) والذي يعرف على أنه التركيز الذي يختزل تركيز المركب المعقد المكون من (DPPH-radical) بنسبة (50 %) بالمقارنة مع السيطرة بملاحظة قيم (Ec50) لكل من (BHT) وفيتامين(C) , جدول رقم (3). ان كفاءة الفعالية المضادة للاكسدة تتناسب عكسيا مع قيمة (Ec50)، كما ان (Ec50) للمستخلص الأقل من (10 ملغم / مل) تدل على أن المادة كفؤة كمضادة للاكسدة، كانت قيمة (Ec50) لنموذج رقم (3) اقل من (10 ملغم / مل) ، كذلك بالنسبة للنماذج (1) و(2) لكن بكميات متفاوتة مقارنة مع مضادات الاكسدة (BHT) وفيتامين (C) . اثبت اختبار السمية الذي اجري على الحيوانات المختبرية (الفئران) ان المستخلص النباتي الكحولي المحضر غير سام من خلال عدم تسجيل اي اعراض غير طبيعية على الحيوانات بعد تجريعها بالمستخلص المحضر من بذور العنب الاحمر بالتراكيز الثلاثة خلال الساعات الاربع الاولى وبعد مرور (24 ساعة( من الاختبار. الاستنتاجــــات 1- أظهرت فحوصات كشف المكونات الفعالة للمستخلصات أنها تتأثر بطبيعة المذيب من الناحية القطبية والتي تؤثر في المجاميع المستخلصة وبطريقة الاستخلاص، حيث لكل مجموعة مواصفات وخصائص فعالية معينة. 2- أظهرت نتائج فحص السمية للمستخلص الكحولي لبذور العنب الاحمر أنه غير سام . 3- أظهرت نتائج فحص الفعالية المضادة للأكسدة لنموذج رقم (3) اقل من) 10 ملغم / مل) ، أنها أفضل وأقوى مقارنة بالمستخلصات للنموذجين (1) و(2) اللذين لايقلان فعالية مقارنة مع مضادات الاكسدة (BHT) وفيتامين (C) لكن بنسب متفاوتة.

التوصيـــــــــات 1- عمل دراسة أنسب ظروف أستخلاص بذور العنب الاحمر، وملاحظة مدى تأثيرها على المجاميع الفعالة. 2- إجراء فحوصات بجهاز) GC-mass) للكشف عن مكونات المستخلصات التي يحصل عليها والمقارنة بينهم .

المصـــــــــــادر 1- Catterall ,F.; Souqet ,J. M.; Cheynier, V. ; de pascual – Teresa, S . ; Santos –Buelga, C.; Clifford, M. N. and loannides, C .( 2000 ). Differential Modulation of the Genotoxicity of Food Carcinogens by Naturally Occurring Monomeric and Diemericpolyphenolics .Enviromental and Molecular Mutagenesis, 35 : 68-98. 2- Kuppusamy, K.; Panneerselvam, K. and Viswanathan, P.(2008). Antioxidant efficacy of flavonoid-rich fraction from Spermacocehispida in hyperlipidemic- rats . J. Appl. Biomed. ,6(1214- 0287): 165–176. 3- حجاوي, غسان و المسيمي, حياة حسين و قاسم, رولا محمد جميل. ( 1999). علم العقاقير والنباتات الطبية. مكتبة دار الثقافة للنشر والتوزيع. مطبعة الأرز. عمان /الأردن. 4- العاني, عبدالإله مخلف عبدالهادي وعدنان, ناصر مطلوب ويوسف, حنا يوسف. (1989). عناية وتخزين الفواكه والخضر. وزارة التعليم العالي والبحث العلمي. بغداد. مطبعة بيت الحكمة. 5- Katiyar, S .K . (2005). Silymarin and skin cancer prevention: antiinflammatary, antioxidant and immunodulatory affects. Inc .Oncol., 26 : 169 -167.