- تحضير عدة فحص الدم في الخروج

Abstract

الخلاصة في هذا البحث حضرت عدة لفحص الدم في الخروج باستخدام الشرائط البلاستيكية التي تعتمد مبدأ التفاعل المناعي الكيماوي Immunochemical . يعتمد مبدأ هذا الفحص على تفاعل جزء البروتين من هيموكلوبين الدم مع مستضده المثبت على شريط من النتروسيليلوز. يستخدم هذا الفحص لتشخيص حالات نزف القناة الهضمية التي تسببها العديد من أمراض الجهاز الهضمي. اجري الفحص على (20( عينة براز لأشخاص مصابين بأمراض مختلفة في الجهاز الهضمي و بمقارنة هذه العدة مع عدة أجنبية أعطت نتائج مطابقة . كما قيمت العدة المحضرة بمركزنا في مختبر الصحة المركزي وكانت النتيجة صالحة للإستخدام .

Keywords :- Fecal Occult Blood , rapid test strip . المقدمة يشير مصطلح الدم الخفي في الخروج Fecal occult blood إلى كمية الدم النزفي القليلة في القناة الهضمية والتي لا ترى بالعين المجردة أو حتى الفحص المجهري . إن اختبار الدم الخفي في الخروج من الاختبارات الكيماوية السريرية المغمورة على الرغم من أهميته حيث يفترض ان يكشف النزف في القناة الهضمية سواء كان علويا" أو سفليا" إي انه يستطيع كشف أي تسرب خفيف للكريات الحمراء من الفم إلى الشرج.2,1

أسباب النزف الهضمي :[2,1] يشمل النزف الهضمي الحالات السريرية التالية :- -1 السرطانات المعدية المعوية (Gastrointestinal malignancies) وخاصة سرطان القولون والمستقيم . 2- الزوائد اللحمية في الجهاز الهضمي (Gastrointestinal Polyps) . 3- التهاب القولون المتقرح ((Ulcerative colitis . 4- القرحات الهضمية النازفة (Peptic Ulcer Bleeding) . 5- الناسور ((Fistulas . 6- التشققات الشرجية ((Anal Fissures . 7- الإصابة بالديدان الشصية والسوطية . 8- الالتهاب المعوي القولوني السلي (Tuberculosis Enter colitis) . 9- دوالي المرئ (Esophagus Varicose) . 10- البواسير (Hemorrhoids) . وغيرها . أهمية إجراء فحص الدم في الخروج :- ]6,5,4[ -1 يكشف هذا الفحص النزف الهضمي الذي يعد من أهم أسباب فقر الدم عند الرجال . 2- إن سرطان القولون من الأنواع المميتة من السرطان ولكن يمكن الوقاية منه . ومن البديهي انه كلما أسرعنا في الكشف المبكر عن السرطان كلما زادت قابلية شفاء المريض . أنواع فحوصات الدم السريعة في الخروج باستخدام الشرائط :- (Rapid FOB test strips) ]8,7,1[ -1 الفحص الكيماوي :- ويعتمد على مبدأ ان الهيموكلوبين ومشتقاته يتفاعل بطريقة مشابهة لإنزيم Peroxidase وتسمى فعالية البيروكسيديز الكاذبة ( Pseudo- Peroxidase activity) وباستخدام كاشف مختزل كمادة ((guaiac أو (O- Tolidine) يقوم الهيموكلوبين باختزال انتقال الأوكسجين من بيروكسيد الهيدروجين الى (Guaiac) الذي يتأكسد ويعطي لون ازرق .]7[ Hemoglobin + H2O2 + Guaiac Pseudo-peroxidase O2 Oxidized Guaiac + H2O ازرق اللون ملاحظة : تم تحضير العدة بهذه الطريقة في مختبراتنا وأنتجت سابقاً" في قسم الإنتاج بعقود تسويق مع وزارة الصحة . -1 الفحص الكيماوي المناعي (Immunochemical Fecal Occult blood IFOB) :- ويستخدم مضاد ((anti-human hemoglobin antibodies لتحديد بروتين globin)) في جزيئة (Hemoglobin) البشري وهذا الفحص شديد الحساسية والتخصص ونسبة الخطأ فيه محدودة . وهو الفحص المتبع في هذا البحث . العمل المختبري : 1- المواد المستخدمة في صنع الشريط : - Nitrocellulose Millipore filter paper. - Fibro glass Millipore filter paper . - Millipore filter paper. - Adhesive tapes . - PCV Plastic sheets .

2- المواد الكيماوية : - Hydrogen tetrachloraurate . - Trisodium citrate . - كلوريد الصوديوم (NaCl) . - K2Co3. - Sodium borate (Na2B4 O7.10H2O) - Na2HPO4. - KCl. - Brain heart infusion agar. - Hemoglobin α /β/γ Antibody Human Monoclonal . -Mouse monoclonal antibodies and polyclonal antibodies (sheep or goat) . - Bovine serum albumin (BSA) .

طريقة تحضير المحاليل : ]8,7,1[ تم اعتماد طريقة (Avraham Rasooly, 2009) في العمل (1) . أ- تحضير المحاليل : 1- محلول (W/V 1%)(Hydrogen tetrachloraurate) . أذيب ( g0.1) من HAUCl4)) في (ml 10) ماء مقطر لا ايوني وحفظ في عبوة غامقة . 2- محلول (W/V 1%) (Trisodium citrate) . حضر بإذابة (g 0.5) من (Na3C6H5O7.2H2O) في ( ml50) ماء مقطر لا ايوني . 3- محلول (NaCL)(1 M) : حضر بإذابة ( g0.5) من (NaCl) في ( ml100) ماء مقطر لا ايوني . 4- محلول (0.2M ) (K2Co3) حضر بإذابة ( g2.8) من ((K2CO3 في (100 ml) ماء مقطر لا ايوني . 5- محلول (0.2 M) (Sodium borate) . حضر بإذابة (g 0.76) في Na2B4O7.10H2O)) في (ml 100) ماء مقطر لا ايوني . 6- محلول (Phosphate buffer saline) . - (g 8) كلوريد الصوديوم . - (g 0.4) كلوريد البوتاسيوم . - ( g1.4) فوسفات الصوديوم ((NaHPo4 . - ( g0.2) فوسفات البوتاسيوم (KH2Po4) . أذيبت هذه المواد في (L 1) ماء مقطر لا ايوني . ب- تحضير محلول المقترن (Conjugate reagent) . باستخدام المضاد Hemoglobin α /β/γ Antibody) Human (Monoclonal . ج- محلول خط الفحص (Test line reagent) . حضر بإذابة (mg 10) من (Protein A) في (1 ml) من محلولPBS] ( 7.2 ) [pH وحفظ في درجة ( C° 20- ) . د- محلول خط السيطرة Control line reagent) ) . واستخدم مزيج من : Mouse monoclonal antibodies and polyclonal antibodies (sheep or goat) . هـ - تحضير معلق الذهب Colloidal gold suspension)) : حضر بإضافة ( ml1) من محلول ((AU4Cl4 في (ml 100) ماء مطر لا ايوني وسخن مع التحريك الى درجة الغليان ، ثم أضيف (ml 1) من محلول (Trisodium citrate) مع التحريك المستمر وبالتدريج حتى تغير لون المحلول من الأزرق إلى الأحمر الغامق ومن ثم يبرد إلى درجة حرارة الغرفة ويكمل الحجم إلى (ml 500) بالماء المقطر . ويكون أفضل حجم لدقائق المحلول الغروي بين nm (10 - 40) . تعدل حامضية المحلول إلى (8.5) pH بـاستخدام (0.2)M ((K2CO3 . ويحفظ المعلق الناتج بدرجة حرارة الغرفة . و- اقتران المضاد Hemoglobin α /β/γ antibody) (Human بمعلق الذهب الغروي : 1- اضيف (ml 2) من محلول المضاد إلى (ml 10) من محلول الذهب الغروي وتعدل الدالة الحامضية ((pH إلى (9) مع التحريك المستمر وحضن لمدة (min 25) بدرجة حرارة الغرفة . 2- اضيف حجم (1/10) من (10 %) منBovine serum albumin (BSA) إلى (lμ 20) من (Sodium borate) مزج بسرعة وحفظ بدرجة حرارة الغرفة . 3- رسب المحلول باستخدام جهاز الطرد المركزي(r.p.m 15000) لمدة (min 30) . 4- أخذ الراسب وأذيب في ( μl20) من (Sodium borate) يحوي على (1 %) من (BSA) تحميل المحاليل على أوراق الفحص Membrane Blotting)) : أ- تحضير شريط النموذج والسيطرة Preparation of test & control pad) ) : خفف محلول المضاد (Hemoglobin α /β/γ) إلى تركيز(mg / ml 1) في دارئ الفوسفات درجة حامضية (7.2) لاستخدامها في خط الفحص Test line)) . كما خفف محلول المضاد Mouse monoclonal antibodies and polyclonal antibodies (sheep or goat) بنفس الطريقة لتحضير خط السيطرة control line) ) . - قطع الورق (nitrocellulose) بشكل شرائط بقياس cm2(2.5×30) وحمل بالمضاد بمعدل ( cm / micron 1) كل على حدة . - وضع خط الفحص وخط السيطرة بشك متوازي على طبقة PVC)) بينهما مسافة ( cm0.5) - جفف الشرائط بعد التحميل في فرن بدرجة ( C°42) لمدة (min 30) . ب- تحضير الشريط المقترن ((Preparation of Conjugate Pads : - قطع شريط الألياف الزجاجية Fiber glass إلى شرائط بقياسcm2 (1.5×30) . - أضيف (ml 1) من محلول المقترن إلى (ml 2) (20 sodium borate µm) و(W/V2 %) (BSA) و (V/V 0.2 %) من مادة Tween 20) ) . - غمست الشرائط في محلول المقترن إلى درجة التشبع ومن ثم جففت بدرجة (C° 42) لمدة ( min30). جـ- تحضير شريط الامتصاص (Preparation of Absorbent Pads) . - قطعت شرائط الترشيحFilter paper بقياس cm2 (2.5 ×30) . - وضع شريط اللصق على الجهتين وحفظ بدرجة حرارة الغرفة. تجميع الشرائط Assembling of pads)) : - استخدمت صفيحة بلاستيكية بيضاء من مادة (PCV) بعرض (cm 0.3) , وصفت فوقها شرائط الفحص باستخدام شريط اللصق . - وضعت الشرائط في مغلف ألمنيوم مع مانع للرطوبة وأغلقت جيداً . - حفظت الشرائط بعد التغليف بدرجة C° (2 - 8) لحين الاستخدام . طريقة إجراء الفحص :- ]8[ تحتوي كل عدة على ما يلي :- -1 أنبوب جمع العينات ويحوي في داخله مقدار(ml 10) من )]( 7.2( (pH [PBS ويكون غطاءه مرتبط بعصا بلاستيكية رقيقة لرفع قطعة صغيرة من عينة البراز . 2- تغمس العصا البلاستيكية في أجزاء عشوائية من العينة ويتم التخلص من الأجزاء الزائدة من العينة وتعاد العصا البلاستيكية إلى الانبوبة وتغلق جيدا. 3- ترج الانبوبة جيدا للتأكد من تجانس توزيع العينة في السائل. 4- تؤخذ (2-3) قطرات من السائل الحاوي على العينة وتوضع على الموضع المخصص للعينة . انتظر لمدة (min 5) لقراءة النتائج. قراءة النتائج :- 1- النتيجة الموجبة ((Positive : عند ظهور خطان ملونان باللون الوردي خلال ( min5) من إجراء الفحص تعتبر النتيجة موجبة وتشير إلى وجود الهيموكلوبين في العينة . -2 النتيجة السالبة (Negative) : إذا لم يظهر اللون في منطقة الفحص (test area) وظهر اللون فقط في منطقة السيطرة control area) ) تعتبر النتيجة سالبة . 3- غير معتمده (باطلة) (Invalid) : في حالة عدم ظهور لون في منطقة السيطرة control area) ) وبدون الأخذ بالاعتبار أي لون يظهر في منطقة الفحص test area تعتبر النتيجة باطلة وغير معتمدة . طريقة العمل 1- أخذت (3) عينات عشوائية من البراز لأشخاص طبيعيين لتكون قاعدة للمحاليل القياسية (control solutions) . 2- أذيب الهيموكلوبين في محلول بفر (PBS) بدرجة حامضية ( 7.5 pH= ) وبالتراكيز التالية : µg / ml ( 0.05 , 0.1 , 0.2 , 0.5 , 20 ، 2000 ) . 3- خلطت عينات البراز مع المحاليل المخففة في أنبوبة جمع العينات ومزجت جيدا بجهاز (vortex) . 4- أٌجرى الفحص بالطريقة الموضحة في طريقة إجراء الفحص [8] وتقرأ النتائج .

النتائج والمناقشة -1 يلاحظ إن جميع العينات بتركيز اقل من (µg/ml 0.2) هيموكلوبين أعطت نتائج سالبة . 2- إن حساسية الفحص تبدأ من التركيز (µg/ml 0.2) وقد أعطت جميع العينات نتيجة موجبة ولكافة التراكيز أكثر من (µg/ml 0.2) الجدول (رقم 1) 3-عند إجراء الفحوصات لنفس العينات وباستخدام نفس المحاليل المخففة للهيموكلوبين وبالمقارنة مع عدة أجنبية لشركة (HEALTH MATE) الكورية كانت النتائج مطابقة (100 %) . 4- في دراسة أجريت للمقارنة بين الفحص المناعي للدم في الخروج (IFOB) والفحص الكيماوي باستخدام guaiac test (gFOB) أثبتت النتائج التالية] 9[ : - الحساسية (Sensitivity) : حيث اتضح من خلال هذه الدراسة أن الفحص المناعي أكثر حساسية في تشخيص سرطان القولون (colorectal cancer CRC) باحتمالية ( 0.01 P < ) وتشخيص الأورام المتقدمة (advanced adenoma AA ) باحتمالية (0,05 P < ) مقارنة مع (gFOB) . - الخصوصية ((Specificity : اتضح من خلال هذه الدراسة ان فحص (gFOB) أكثر خصوصية وبشكل واضح من الفحص المناعي (IFOB) في تشخيص (CRC) و ((AA . أخذت (20) عينة براز عشوائية لمرضى مصابين بأمراض مختلفة في الجهاز الهضمي من مختبر الصحة المركزي .وعند إجراء الفحص باستخدام العدة البحثية ومقارنتها مع العدة الأجنبية كانت النتائج متطابقة .و أعطت النماذج النتائج المبينة في الجدول (رقم 2) . وظهر خط الفحص (test line) خلال فترة ( min5) للنماذج الموجبة كما ظهر خط السيطرة (control line) في جميع القراءات الموجبة والسالبة أيضا .إن الفحوصات الموجبة توضح وجود الهيموكلوبين في عينات البراز وهي دلالة على الإصابة بتقرحات القناة الهضمية.والتي تعتبر مؤشرا مهما لتشخيص سرطان القولون المبكر.

جدول رقم ( 1 ) يوضح حساسية العدة المحضرة لتراكيز مختلفة من الهيموكلوبين بعد مزجها مع (3) عينات طبيعية من البراز Sample 3 Sample 2 Sample 1 Units Hemoglobin No. - - - µg/ml 0.05 1. - - - µg/ml 0.1 2. + + + µg/ml 0.2 3. + + + µg/ml 0.5 4. + + + µg/ml 20 5. + + + µg/ml 2000 6.

جدول رقم (2) يوضح عدد النماذج الموجبة والسالبة التي فحصت باستخدام الشرائط المحضرة في مركزالرازي مقارنة بالعدة الأجنبية من شركة ((HEALTH MATE

No. of samples Results AL-Razi strip HEALTH MATE strip 20 Positive Negative Positive Negative 13 7 13 7

References 1-Avraham, R. and Keith, E. (2009). Biosensor and Biodetection Electrochemical and Mechanical detection , In "Lateral flow and ligands for Biosensors "4th Edt P:217. 2-Adams, C. and Layman, M.(1974). Immunochemical confirmation of gastrointestinal bleeding. Ann. Ehn. Lab. Sci. 4:343 3-Salto, H.(1984). An immunological occult blood test for mass screening of colorectal cancer by reverse-passive hem agglutination (RPI-IA). Japanese J. Gastroenterology. 61:2831. 4-Saito H. (1996). Screening for colorectal cancer by immunochemical fecal occult blood testing. Japanese J Cancer Res.87:1011. 5-Ribet, A., Frexinos, J. and Escourrou, J. (1980). Occult-blood test and Colorectal Tumors. Lancet. 1:417. 6-Allison, B., Takawa, S., Ransom, J. and. Adrian, L. (1996). A comparison of fecal occult blood test for colorectal -cancer screening. Engl. J. Med. 334:155. 7-Patent,W. (2013). Method's and Device for the detection of occult blood. US.Patent.8 : 349. 8-Pertti, V. and Raimo, T. (1988). Rapid Immunochemical Detection of occult blood by use of a latex agglutination test. clin . chem. 34: 1763 . 9-Park, D.I; Ryu, S; Kim, Y.H; Lee, S.H; Lee, C.K. and Eun, C.S. (2010). Comparison of guaiac-based and quantitative immunochemical fecal occult blood testing in a population at average risk undergoing colorectal cancer screening. Am. J. Gastroenterol. 105:2017-25.