تحضير عدة خاصة بالترحيل الكهربائي للكشف عن حزم DNA))

Abstract

• الخلاصة • أستخدمت تقنية الترحيل الكهربائي للكشف عن حزم الأحماض النوويةDNA) و RNA) ، تضمن البحث تحضـــــير عــــــــــــــدة خاصة بالــــــــــــترحيل الكهربائي مـــكونة مــــــــن عدة أنواع مـــــــــــن المحاليل الدارئة Tris - - Acetate Ethylene Diamine Tetra Acetic acid buffer (TAE) وTris Borate Ethylene - Diamine Tetra Acetic acid buffer - (TBE) و محلول صبغة التحميل (Loading dye) واكاروز agarose)) .أستخدمت صبغتي الاثيديوم برومايد (Ethidium Bromid) والسايبر كرين Syber green)) في عملية الترحيل الكهربائي ، رحلت نماذج دم بشرية مع إضافة الدليل الحجمي DNA Ladder) ) إذ اثبتت العدة كفاءتها بظهور حزم واضحة منDNA) ) على شريحة الاكاروز بعد الكشف عنها بمصدر للاشعة فوق البنفسجية وعند مقارنتها مع نتائج العدة الأجنبية .

• الكلمات المفتاحية : Electrophoresis , Ethidium Bromide , Syber green .

• المقدمة • أستخدمت تقنية الترحيل الكهربائي في هلام اكاروز(Agarose Gel electrophoresis) : تقنية تستخدم لعزل المواد حسب معدل حركتها تحت تأثير المجال الكهربائي و إستعمل الهلام المكون من مادة اكاروز في عملية الفصل, وأثناء عملية الفصل وضعت الشريحة الهلامية داخل وعاء يحوي محلول منظم وفيه قطبان (سالب وموجب).حلل الحامض النووي عن طريق وضعه في حفر خاصة في الهلام دفع للامام بوساطة فرق الجهد الكهربائي فبدأ الحامض النووي بالانتقال الى القطب الموجب [1] .وتأثرت هذه التقنية بقوة فرق الجهد , وتركيز اكاروز , وحجم قطعة الحامض النووي (DNA) , ونوعية وحالة اكاروز. و تستخدم عادة وحدة الترحيل الأفقية لهلام اكاروز, والحمض النووي ذاته غير مرئي في الهلام, لهذا صبغ بمادة ترتبط به قبل وضع العينات في الهلام مثل مادة الاثيديوم برومايد EtBr) ) التي تتألق عند تعرضها للأشعة فوق البنفسجية. وأكثر المحاليل المنظمة المستخدمة لتنشيط المواد الهلامية (اكاروز) هي تريس خلات (TAE) مع ((EDTA وتريس بورات TBE)) مع (EDTA). لأن كلا منها لديها درجة حموضة معتدلة ، و(DNA) لديه شحنة سالبة صافية تهاجر نحو القطب الموجب [1] . • الصبغة البديلة ل ((EtBrهي Syber green)) ، وكذلك (methylene blue وcrystal violet) التي لا تتطلب تعريض الهلام للأشعة فوق البنفسجية لرؤية شرائح الحامض النووي التي تستخدم في حالة استرداد جزء من الحامض النووي من الهلام إلا ان هذه الاصباغ أقل حساسية من EtBr و Syber greenعلى حد سواء للأشعة فوق البنفسجية وأقل سمية من EtBr، لكنها أكثر تكلفة بكثير. يمثل سلم الحامض النووي (DNA- Ladder) - مرجعٍ قياسيٍ لتقدير حجم جزيئات الحامض النووي المستخدم في الترحيل الكهربائي[2].

• الجزء العملي • تحضير : EDTA Stock (0.5 M) • حضر باذابة (g 93.06) من مادة(EDTA) في (400 ml) ماء مقطر وضبط المحلول الدارئ على (8 ) بأستخدام (10 g) من (NaOH) ، أكمل الحجم الى (500 ml) بالماء المقطر .

• تحضير(1L) من : TBE Buffer (10X) • حضر باذابة (108g) من(Tris Base) و(55g) منBoric Acid) ) و(40ml) من EDTA(0.5M) , ضبط المحلول الدارئ على 8.3)) واكمل الحجم الى (1L). • تحضير (1L) من TAE (50X) : • حضر باذابة (242 g) من Tris Base و(57.1 ml) حامض الخليك الثلجي و(100 ml) من EDTA(0.5M) ، ضبط المحلول الدارئ على (7) وأكمل الحجم الى (1L). • تحضير محلول صبغة التحميل Loading dye (6x) • حضر باذابة (25 mg) من Bromophenol blue) ) ، (25 mg) من ((Xylene cyanol و (4g) من (Sucrose) ،أكمل الحجم الى (10 ml) . • تحضير اكاروز: • وحضر وزن (0.8 g) من اكاروز في (100 ml) من محلول الدارئ (TBE (1 X محلول الدارئ (1) TAE X ، اضيف إليه 5μl)) من محلول صبغة بروميد الاثيديوم (Et Br) بتركيز( 5mg / ml) عند استخدام Et Br t Br)). اما عند استخدام (Syber green) حضر محلول اكاروز بدون إضافة الصبغة . • طريقة الفحص : • صب الهلام على الشريحة بعد غمس مشط الحفر (Comb) قرب إحدى نهايتي الصفيحة وترك الهلام ليتصلب لمدة ( (30دقيقة , رفع المشط منه وغمر بمحلول TBE)أو(TAE في وحدة الترحيل الأفقية . في حالة استخدام صبغة ( Et Br) مزج ( (6µlقريبا من ال DNA) أو (Ladderمع (lμ4) مـن محلول دارئ التحميل (Loading buffer) ووضعت في الحفر المخصصة في الهلام . • في حالة استخدام صبغة(Syber green) مزج 100μl)) من محلول دارئ التحميل (Loading buffer ) مع (50μl) من صبغة الـ(Syber green) ، أخذ (lμ4) من هذا المزيج وأضيف اليه 6μl)) تقريباً من الـ DNA) او(Ladder ووضعت في الحفر المخصصة في الهلام . • رحلت العينات بعد ربط الشريحة بالتيار الكهربائي وبجهد كهربائي يقارب 90V)) وتيار( (120 Aلمدة • h(1-(2 حتى بلغت الصبغة الدالة قرب نهاية الهلام . • كشف عن ال (DNA) بتعريض الهلام إلى الأشعة فوق البنفسجية بوساطة جهاز ((UV transilluminator.

• النتائج والمناقشة • أستخلص DNA) وRNA ) من نماذج دم بشرية بأستخدام عدة ( DNA Extraction kit) و • RNA Extraction kit)) من شركة ((Geneaid وفق خطوات العمل الخاصة بكل عدة , قيس تركيزعينات DNA) و(RNA باستخدام جهاز Nanodrop)) أظهرت نتائج القياس DNA=1.7~ RNA=1.9~ . • وهذه النتائج دلت على عدم وجود تلوث في العينة المستخلصة , وغير حاوية على البروتين أو بعض المواد الاخرى ، رحلت نماذج (DNA) مع الدليل الحجمي باستخدام العدة المحضرة والعدة الأجنبية مع الصبغتين (Syber green وEt Br) , أظهرت مواقع حزم واضحة بشكل جيد كما في الاشكال رقم (2,3) فضلا عن مقارنة نتائج العدة المحضرة مع نتائج العدة الاجنبية إذ أظهرت نتائج متطابقة عند تعرضها للاشعة فوق البنفسجية مما دل على كفاءة وحساسية العدة المحضرة . • استخدم محلول TBE (1X) لترحيل قطع (DNA)الصغيرة ( 1000 >زوج قاعدة ) وذلك لقوة وقدرة تخزينه الأيوني العالي . ولفصل قطع (DNA) الكبيرة (12- 15) كيلوبايت أستخدام المحلول ( 1X ) TAE)) الذي أدى إلى انخفاض التناضح الكهربائي , أستعملت صبغة ـ(Syber green) كونها الصبغة الاكثر امناً والأقل خطورة من صبغة الاثيديوم برومايد(EtBr) [3].

• • شكل رقم (2) الترحيل الكهربائي بأستخدام صبغة EtBr ,Geneaid Kit Razi ) )

• • شكل رقم (3) الترحيل الكهربائي بأستخدام صبغة) (Syber greenGeneaid Kit Razi

• Reference • SamehMagdeldin, ed. (2012). Gel electrophoresis– Principles and Basics. In Tech. ISBN 978-953-51-0458-2. • Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. • Zimm BH, Levene SD. "Problems and prospects in the theory of gel electrophoresis of DNA" (PDF). Quarterly Reviews of Biophysics 25 (2): 171–204(1992) .